本发明专利技术提供了一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1及其制备方法，本发明专利技术的强化因子为沉默细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）的重组复制缺陷型腺病毒rAd-sh-RNA-SOCS1;感染DCs后采用肿瘤特异的CTL表位多肽脉冲DCs使其成熟为mDCs,再然后与自身外周血体外扩增的CIK细胞共培养，它们之间的相互作用大大强化了对肿瘤细胞的特异性杀伤，突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受，在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中，具有良好的治疗效果。此外，该病毒感染的DC细胞也可以与其他免疫效应细胞，如CTL、NK、γδT和TIL细胞等，联合用于肿瘤，包括但不限于宫颈癌的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及强化树突状细胞（dendritic cells,DCs）-免疫效应细胞治疗肿瘤的方法，具体地，涉及一种修饰的树突状细胞-效应细胞用于肿瘤治疗的方法，尤其是一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1及其制备方法，以及用该病毒强化DC-效应免疫细胞在治疗肿瘤中的用途。
技术介绍
癌症问题日趋严峻，癌症的预防与控制面临巨大挑战。世界卫生组织国际癌症研究中心认为，未来癌症发病人数年均将会以3%-5%的速度递增，预计2020年全球将有2000万癌症新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远高于发达国家。我国癌症呈明显高发态势，目前，城市中癌症已经占到死亡总数的25%，农村为21%，已出现癌症乡和癌症村。癌症患者年轻化趋势也比较明显。目前癌症治疗的主要方法为手术、放化疗。这些治疗方法对癌症有一定疗效，但同时对患者有严重副作用，甚至加速肿瘤的转移和对放化疗的耐受。肿瘤的绿色治疗已受到越来越多的关注。癌症的免疫治疗是继上述手术、放疗和化疗的第四种治疗方法，是最有可能彻底治愈肿瘤的绿色治疗方法。 树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是最专业的抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APCs），在先天性和适应性免疫中处于中心地位，能够加工处理和递呈抗原肽给初始T细胞（ T Cells），从而诱发CD4+辅助性T细胞（helper T cells，Th）和CD8+细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes， CTLs）介导的细胞免疫应答；也能激活自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）【Fernandez NC,Lozier A,Flament C,et al.Dendritic cells directly trigger NK cell functions:cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo.Nat Med1999,5:405–411.】和NK样T细胞（NKT）【Kadowaki N,Antonenko S,Ho S,et al.Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells.J Exp Med.2001,193:1221–1226.】。但肿瘤组织微环境抑制其产生和成熟，导致DCs数量减少而且存在功能缺陷【Aalamian M,Pirtskhalaishvili G.,Nunez A,et al.Human prostate cancer regulates generation and maturation of monocyte-derived dendritic cells.Prostate2001,46(1):68-75.】。DCs的缺乏和功能不良是肿瘤免疫逃逸以及其他免疫治疗不能取得良好效果的一个重要原因。纠正肿瘤患者DCs功能缺陷以诱发或增强机体对肿瘤的免疫应答，这已成为晚期肿瘤免疫治疗新的切入点。例如，Waeckerle-Men等【Waeckerle-Men Y,Allmen EU,von Moos R.,et al.Dendritic cells generated from patients with androgen-independent prostate cancer are not impaired in migration and T-cell stimulation.Prostate2005,64(4):323-331.】研究显示来源于HRPC病人的单核细胞来源的DCs在体外培养和修饰后能激活同源的CD4+和CD8+T细胞并呈递抗原产生特异性的CTLs，有效地启动免疫应答。 体外培养获得大量的DCs使得利用DCs疫苗进行免疫治疗成为可能，图9-1【Karolina P,Jacques B.Cancer immunotherapy via dendritic cells[J].Nature Reviews Cancer，2012(12):265-277】展示了数树突装细胞对肿瘤的免疫治疗途径，而选择合适的肿瘤抗原及装载方式于体外构建的DCs疫苗成为DCs疫苗抗肿瘤免疫治疗的关键。适合负载DCs的抗原有多肽、蛋白、DNA、RNA、灭活的肿瘤细胞以及含抗原的重组病毒。2010年4月，美国食品药品监督局（FDA）批准前列腺癌疫苗Provenge（sipuleucel-T）上市，这 是一种新型的自体源性细胞免疫疗法药物【Sharma P,Wagner K,Wolchok JD and Allison JP.Novel cancer immunotherapy agents with survival benefit:recent successes and next steps.NATURE REVIEWS|CANCER2011,11:805-812】，其负载方式是GM-CSF和PSA融合的蛋白抗原，这种抗原负载方式存在效率低下的缺陷。DCs疫苗临床使用效果存在个体差异，其主要原因包括：缺乏刺激因子，抗原呈递弱化因子的作用和无效的抗原负载。自身耐受仍然维持在原来的自然免疫抑制环境，从而妨碍了DCs肿瘤疫苗的疗效和作用。因此，采用某些方法和技术来增强DCs摄取提呈抗原等的功能是提高疫苗效能的关键。 在肿瘤的免疫细胞治疗中，诱发MHC限制性的CTLs应答是最有效的免疫治疗方式之一。然而，CTLs的准备需要反复刺激，是一个复杂而耗时的过程。而且，在应用DCs疫苗时，因肿瘤患者体内存在复杂的免疫抑制限制了疫苗诱导CTLs克隆的大量产生，影响治疗效果，因此联合疫苗和体外诱导的大量特异性免疫效应细胞，将可能更有效地提高抗肿瘤免疫能力。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIKs）是一群具有高增殖活性和非特异性细胞毒性的过继免疫杀伤细胞【Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.J Exp Med.1991,174:139–149;Lu,PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency.J Immunol1994,153:1687–1696.】，P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种复制缺陷性重组腺病毒rAd‑RNAi‑SOCS1，其特征在于，该制缺陷性重组腺病毒rAd‑RNAi‑SOCS1表达如下序列的双链RNA：5’‑GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTTTG‑3’；5’‑AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTCAGGTAGG‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，其特征在于，该制缺
陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1表达如下序列的双链RNA：
5’-GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTC
AGGTAGTTTTTTG-3’；
5’-AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAG
GAACTCAGGTAGG-3’。
2.如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，其特征
在于，所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的表达系统为Adeno-X。
3.如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，其特征
在于，所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染树突状细胞（DCs）,
并使DCs内的SOCS1表达沉默。
4.如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，其特征
在于，所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的病毒滴度为
2.5-2.8X107pfu/ml。
5.如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，其特征
在于，所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs后，用合成的
HPV16E7.49-57表位多肽脉冲被腺病毒感染的DCs，用TNF-α使DCs成熟，与
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【专利技术属性】
技术研发人员：都会，郑义，李智龙，
申请(专利权)人：深圳市金佳禾生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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