免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种河豚毒素的检测方法，特别涉及一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种天然海洋生物神经毒素，分布广泛，主要存在于河豚鱼中，圆尾鲎、蓝环章鱼、螺类等其他动物体内也有存在。河豚毒素毒性极强，食用0.5mg就可致人死亡，其带正电荷的胍基能伸入钠通道的离子选择过滤器，和通道内壁上的游离羧基结合，阻碍钠离子进入，从而抑制神经冲动的传导，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。我国每年都有因食带有TTX的海洋生物而导致中毒的事件发生。鉴于河豚毒素的严重危害，有必要建立一种简便、能有效检测河豚毒素的方法。目前，河豚毒素的检测方法有生物测定法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MS)及酶联免疫法(ELISA)等。其中生物测定法一般需要专门动物，适用性差，且操作繁琐，费时费力重复性差；酶联免疫法虽特异性强，但酶联免疫反应耗时长，操作难度较大；液相色谱串联质谱法灵敏度高，但现有的文献方法检出限偏高，前处理复杂，且采用的固相萃取技术净化样品不理想、易受基质干扰，回收率低。免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性制作而成，具有独特的选择专一性和良好的吸附净化性能。目前，尚未有以免疫亲和柱作为前处理净化手段检测河豚毒素的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以下步骤：(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液；(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相定容溶解得净化液；(3)液相色谱-质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得河豚毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。本专利技术开发了独特的样品处理工艺及制备了对TTX独特选择识别性的免疫亲和柱，配合优化的液相色谱-质谱分析方法，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素作为优选，步骤(2)中流动相配比为：含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％。作为优选，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。作为优选，步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。作为优选，步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为0.3μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和20.0μg/L的标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。作为优选，所述免疫亲和柱的制备方法为：A、抗原合成免疫原的合成：在小烧瓶中依次加入10mg的BSA，2mL 0.05M pH7.4乙酸钠缓冲液，1mg的TTX，60μL的37％(质量浓度)的甲醛，混匀，37℃搅拌48h。然后用0.1M pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，免疫原TTX-BSA；此抗原用作免疫。检测原的合成：用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成检测原TTX-OVA，用于ELISA实验的包被。B、单克隆抗体制备及纯化取5只，6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射TTX-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用TTX-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用TTX-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被TTX-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞；BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×107个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG亲和层析法进一步纯化获得TTX单克隆抗体；C、亲和柱制备称取0.5g CNBr活化的Sepharose 4B干粉用100mL 1M HCl溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液(0.1mol·L-1NaHCO3，0.5mol·L-1NaCl,pH8.3)洗涤得凝胶；取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的TTX单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液(0.1mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mLPBS(0.01M pH7.3)缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有0.05％硫柳汞及0.05％BSA的0.01M pH7.3PBS溶液，于2～8℃储存。作为优选，偶联缓冲液组成为：0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH8.3。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫亲和柱净化‑液相色谱‑串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液；(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相定容溶解得净化液；(3)液相色谱‑质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱‑串联质谱仪测定获得河豚毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。

【技术特征摘要】
1.一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其特征在
于，包括以下步骤：
(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL
含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，
6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液
进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液；
(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱
内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱
液于60℃氮气吹干，用1mL流动相定容溶解得净化液；
(3)液相色谱-质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得河豚
毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中流动相配比为：含0.1％甲酸
的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：ACQUITY
UPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；
流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，
5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，
正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱
溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)中标准曲线的制作
方法为：配制浓度为0.3μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和20.0μg/L
的标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述免疫亲和柱的制备方法为：
A、抗原合成
免疫原的合成：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小军，王莹，伦丽丽，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，江苏美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33