饲用葡萄糖氧化酶的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，以解决现有普通固态发酵技术发酵条件难以控制的问题。该饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，是将活化的特异青霉经至少一次培养得到特异青霉种子，然后采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、发酵菌种干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。本发明专利技术易于控制，不易污染杂菌，而且不产生“三废”，对环境无污染；发酵结束后，不需要对发酵产物——葡萄糖氧化酶进行提纯，即可直接将米渣和/或米糠、特异青霉菌种以及产物葡萄糖氧化酶一起干燥，制成饲用葡萄糖氧化酶。不仅工艺简单，而且可促进米渣和/或米糠进行生物循环利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属饲料加工领域，具体来说，涉及一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法。
技术介绍
葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内。但是动植物体中的葡萄糖氧化酶酶量不丰富，因此从动植物体中提取葡萄糖氧化酶具有一定的局限性。霉菌在一定的条件下，产生葡萄糖氧化酶的能力强，便于大规模生产葡萄糖氧化酶。大规模生产葡萄糖氧化酶的主要霉菌来源于黑曲霉和青霉菌。酶的生产方法可分为提取法、发酵法以及化学合成法。发酵法是20世纪50年代以来酶生产的主要方法。现有饲用葡萄糖氧化酶的工业化生产方法一般采用液态深层发酵技术，但该方法对原料的要求高，主要以优质绵白糖为原料，生产过程中产生的废水、废渣、废气对环境污染较重。普通固态发酵虽然对原料要求粗放、得率高而且基本对环境无影响，但其设备自动化程度偏低、发酵过程难以控制而且容易染菌。专利号为201110138571.8的专利虽然应用了固态发酵技术，但属于简单固态发酵，需要大量劳动力，发酵条件难以控制，容易染菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，以解决现有普通固态发酵技术发酵条件难以控制的问题。本专利技术目的通过以下技术方案实现：所述饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，是将活化的特异青霉经至少一次培养，得到特异青霉种子，然后采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵培养结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、发酵菌种干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的方法是：以米渣和/或米糠为固体培养基，将所述米渣和/或米糠、水投入流化床固态发酵罐，灭菌并冷却，将所述特异青霉种子转接至所述米渣和/或米糠，拌匀，通入无菌空气，培养。在所述培养过程中可以向流化床固态发酵罐中补充糖。流化床固态发酵罐中米渣和/或米糠占45～55％，其中米渣和米糠优选比例是2～4︰1，水占45～55％，特异青霉种子的接种量为1～5％。所述流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的发酵条件优选：在28～32℃条件下保压0.06～0.15MPa，培养18～24h时补加0.05～0.1％绵糖，继续培养12～24h；固态发酵结束后，50～60℃干燥并粉碎，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。所述活化的特异青霉优选经一级种子培养、二级种子培养、种子培养，得到特异青霉种子。一级种子培养是将活化的特异青霉转接至一级液体种子培养基培养，得到一级种子，所述一级液体种子培养基包括1～2％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。二级种子培养是将一级种子转接至二级液体种子培养基培养，得到二级种子，所述二级液体种子培养基包括1.5～3％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。种子培养是将二级种子转接至种子培养基培养，得到特异青霉种子，所述种子培养基包括2～4％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。本专利技术的优点：与普通固态发酵技术相比，本专利技术采用的是流化床固态发酵法，发酵条件易于控制，不易污染杂菌，而且不产生“三废”，对环境无污染。采用可以作为饲用的米渣和/或米糠作为特异青霉种子的固体培养基，发酵结束后，不需要对发酵产物——葡萄糖氧化酶进行提纯，即可直接将米渣和/或米糠、特异青霉菌种以及产物葡萄糖氧化酶一起干燥，制成饲用葡萄糖氧化酶。不仅工艺简单，而且可促进米渣和/或米糠进行生物循环利用。与用普通固态发酵技术生产饲用葡萄糖氧化酶相比，本专利技术生产的葡萄糖氧化酶活力高。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术使用的特异青霉通过商业购买方式获得。本专利技术的饲用葡萄糖氧化酶成品的酶活力检测方法如下：第一步，饲用葡萄糖氧化酶成品中加入蒸馏水稀释，使葡萄糖氧化酶的酶液浓度在2.4～3.5U/mL，记录稀释倍数f然后摇匀，于4～8℃冰箱中浸提15～16小时，过滤，该滤液作为测定液；第二步，取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL，于恒温摇床上30℃、150rpm预热3分钟，准确加入上述测定液1.00mL，立即置恒温摇床上，30℃、150rpm振荡反应60分钟，取出；第三步，立即加入0.1mol/L氢氧化钠溶液20.00ml，振摇终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数A。第四步，取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20.00mL，摇匀，再加入酶液1.00mL，酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数B。第五步，计算：葡萄糖氧化酶活力单位(GOD U/g)＝60(B-A)×N×f×1000式中：A――反应后消耗的盐酸(mL)；B――反应前消耗的盐酸(mL)；N――盐酸摩尔浓度(mol/L)；f――稀释倍数；60――为反应60分钟，按分钟计。1个单位的葡萄糖氧化酶的活性(1U)定义为：在pH 5.6的磷酸缓冲液、30℃温度的条件下，每分钟催化氧化1μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸的酶的量，为一个酶活力单位，以GODU表示。实施例1饲用葡萄糖氧化酶的生产方法如下：第一步，菌种活化：将高产葡萄糖氧化酶的特异青霉的斜面取出，划线接种于直径为10cm的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，下同)固体培养平皿，28℃条件下培养72h，再涂布接种于直径为20cm的PDA固体培养平皿，28℃条件下培养48h，得活化的特异青霉。马铃薯琼脂培养基的配制：去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮汁30min，纱布过滤，滤液中添加琼脂15g，继续加热搅拌混匀至琼脂溶解，再加入20g葡萄糖，补蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min，铺平皿备用；第二步，一级种子培养：一级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，将活化的特异青霉转接一级种子培养基，接种量为一个20cm培养皿接种5L液体种子培养基，接种后于32℃培养72h，得到一级种子液。所述一级液体种子培养基配制方法：2％米渣，0.2％NaCl，0.2％CaCl2，0.2％KH2PO4，0.06％MgSO4·7H2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，将活化的特异青霉经至少一次培养，得到特异青霉种子，其特征是：采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵培养结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、特异青霉种子干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。

【技术特征摘要】
1.一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，将活化的特异青霉经至少一次培养，
得到特异青霉种子，其特征是：采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发
酵培养结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、特异青霉种
子干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。
2.如权利要求1所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述采
用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的方法是：以米渣和/或米糠为所述固体
培养基，将所述米渣和/或米糠、水投入所述流化床固态发酵罐，灭菌并冷却，
将所述特异青霉种子转接至所述米渣和/或米糠，拌匀，通入无菌空气，发酵培
养。
3.如权利要求2所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述米
渣和/或米糠占45～55％，水占45～55％，所述特异青霉种子的接种量为1～5％。
4.如权利要求2所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：在所述
发酵培养过程中向流化床固态发酵罐中补充糖。
5.如权利要求4所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述发
酵培养是在28～32℃条件下保压0.06～0.15MPa，培养18～24h时补加所述米渣
和/或米糠总质量的0.05～0.1％的绵糖，继续培养12～24h，然后于50～60℃干燥
并粉碎，即为饲用葡萄糖氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：周慧，易翠平，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43