用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底多核苷酸的方法和组合物。本发明专利技术还涵盖用于将所加尾的衬底固定至固体支持物的方法和组合物。本公开预期衰减子分子是与添加至衬底多核苷酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至所述衬底多核苷酸的3'末端的所述添加的任何生物分子。添加至所述衬底多核苷酸的序列本文称为尾部序列，或简称尾部，并且将核苷酸添加至衬底多核苷酸的过程本文称为加尾。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2012年3月13日提交的美国临时申请号61/610,296和2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613,784的优先权权益，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。专利
本专利技术涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底多核苷酸的方法和组合物。本专利技术还涵盖用于将加尾衬底固定至固体支持物的方法和组合物。专利技术背景许多当前下一代测序(NGS)平台在测序之前都要求特殊的DNA和RNA制备。最常用的制备涉及通过连接反应将衔接子序列添加至双链DNA片段的末端。所述反应通常涉及平末端DNA或在3'末端处具有单个脱氧腺苷(dA)核苷酸的DNA以及高浓度的DNA连接酶，并且所述反应导致形成大量的嵌合模板。模板依赖性聚合酶如DNA特异性末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及RNA特异性聚(A)和聚(U)聚合酶可能代表用于制备NGS分析所用的DNA和RNA的一种有吸引力的替代方法，其中富有挑战性的问题是由这些酶产生的聚合物尾部的长度在广泛范围(20个至500个核苷酸)内变化，这取决于许多因素并且不易控制，因而降低了它们对NGS的效用。专利技术概述因此，本专利技术提供一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。本专利技术预期所述衰减子分子是与添加至衬底多核苷酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至所述衬底多核苷酸的3'末端的添加的任何生物分子。添加至所述衬底多核苷酸的所述序列本文称为尾部序列，或简称尾部，并且将核苷酸添加至衬底多核苷酸的过程本文称为加尾。如本文所使用的衰减子分子是多核苷酸、多肽、多糖以及其组合。在所述衰减子分子为多核苷酸的方面，进一步预期的是所述多核苷酸为环状分子，或所述多核苷酸包含肽核酸、裂褶多糖(Schizophyllan polysaccharide)、锁核酸以及其组合。如上所述，所述衰减子分子与添加至所述衬底多核苷酸的尾部序列缔合并且控制核苷酸至所述衬底多核苷酸的添加。在一些实施方案中，所述衰减子分子是与添加至衬底多核苷酸的序列杂交的多核苷酸，其中添加至所述衬底多核苷酸的核苷酸的数量基本上等于与所述尾部序列缔合的所述衰减子分子的部分中的核苷酸的数量。在一些方面，添加至所述衬底多核苷酸的核苷酸的数量基本上等于与所述尾部序列缔合的所述衰减子分子中的核苷酸数量的倍数。如本文所使用，术语“基本上”和“基本上等于”应理解成指的是近似或近似相等。在一些实施方案中，所述核酸聚合酶为模板依赖性聚合酶。在一方面，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，并且在另一方面，所述DNA聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在相关实施方案中，所述核酸聚合酶为RNA聚合酶，所述RNA聚合酶在各个方面选自由聚(A)聚合酶、RNA特异性核苷酸转移酶以及聚(U)聚合酶组成的组。本专利技术预期的是，在一些实施方案中，所述衰减子分子包含选自由以下组成的组的核苷酸：2'-脱氧胸苷5'-一磷酸(dTMP)、2'-脱氧鸟苷5'-一磷酸(dGMP)、2'-脱氧腺苷5'-一磷酸(dAMP)、2'-脱氧胞苷5'-一磷酸(dCMP)、2'-脱氧尿苷5’-一磷酸(dUMP)、胸苷一磷酸(TMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、腺苷一磷酸(AMP)、胞苷一磷酸(CMP)、尿苷一磷酸(UMP)、碱基类似物以及其组合。因此，在某些实施方案中，所述衰减子分子包含为杂聚序列或同聚序列的衰减子序列，其中所述序列为二核苷酸序列或同聚物序列。在各个方面，所述衰减子分子包含1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸或更多。在一些实施方案中，所述衰减子分子包含封闭基团，并且在一方面，所述封闭基团位于所述分子的3'末端。所述封闭基团阻止所述衰减子分子通过所述核酸聚合酶的延伸。因此，在各个方面，所述封闭基团选自由以下组成的组：至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核苷酸、C3间隔区、磷酸、双脱氧核苷酸、氨基以及反向脱氧胸苷。在本专利技术的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含位于所述衰减子序列(同聚物序列或二核苷酸序列)5'的衔接子序列、鉴定标签序列，或两者。在一个实施方案中，所述衰减子分子是固定的。在另外的实施方案中，所述组合物中存在连接酶。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含连接酶。在另一个实施方案中，所述衰减子分子是衰减子-衔接子分子，所述衰减子-衔接子分子包含衰减子序列并且进一步包含定位在所述衰减子序列附近并且与单独的多核苷酸上的序列X互补的序列W；所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与序列V互补的序列Y，其中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相同的长度，所述衔接子分子是与所述衰减子-衔接子分子分开的分子。在本专利技术的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含下一代测序(NGS)衔接子序列。NGS衔接子序列与衔接子序列的不同之处在于NGS衔接子序列可用于测序平台。在本专利技术的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含含有序列X和序列Y的下一代测序(NGS)衔接子序列(对于本文论述的各个序列(例如，序列X、序列Y等)的进一步描述，参见以下附图和论述)、鉴定标签序列或其组合，它们位于同聚物序列或二核苷酸序列的5'。在其中所述衰减子分子进一步包含衔接子序列的实施方案中，所述衰减子分子本文称为衰减子-衔接子分子。在一个实施方案中，所述衰减子分子和/或衰减子-衔接子分子是固定的。在相关实施方案中，序列X和序列Y是与Illumina、Ion Torrent、Roche454或SOLiD测序平台相容的NGS衔接子序列。在另外的实施方案中，序列X和序列Y处于单独的衰减子-衔接子分子上，而在其它实施方案中，序列X和序列Y在同一衰减子-衔接子分子上彼此相邻。在一些实施方案中，本专利技术还提供其中衔接子序列进一步包含位于序列X与序列Y之间的可裂解序列(Z)的组合物。在一些方面，序列Z中的裂解位点是至少一个dU碱基或RNA碱基，或限制性核酸内切酶位点。本专利技术还提供其中所述衰减子分子是单链或至少部分是双链的组合物。“部分双链”指的是所述衰减子分子包含单链部分和双链部分。在其中所述衰减子分子至少部分是双链的一些方面，部分双链的衰减子分子通过使衰减子分子的部分退火到衔接子分子(其包含衔接子序列，在一些实施方案中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.13 US 61/610,296;2012.03.21 US 61/613,7841.一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA聚
合酶。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述DNA聚合酶为末端脱
氧核苷酸转移酶(TdT)。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸聚合酶为RNA聚
合酶。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述RNA聚合酶为RNA特
异性核苷酸转移酶。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述RNA特异性核苷酸转
移酶选自由聚(A)聚合酶和聚(U)聚合酶组成的组。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子
包含选自由以下组成的组的核苷酸：2'-脱氧胸苷5'-一磷酸(dTMP)、2'-
脱氧鸟苷5'-一磷酸(dGMP)、2'-脱氧腺苷5'-一磷酸(dAMP)、2'-脱氧胞
苷5'-一磷酸(dCMP)、2'-脱氧尿苷5’-一磷酸(dUMP)、胸苷一磷酸(TMP)、
鸟苷一磷酸(GMP)、腺苷一磷酸(AMP)、胞苷一磷酸(CMP)、尿苷一磷
酸(UMP)、碱基类似物以及其组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子
包含10个核苷酸。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子

\t包含20个核苷酸。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子包含30个核苷酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子包含50个核苷酸。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子包含100个核苷酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子包含3'封闭基团。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述封闭基团选自由以下
组成的组：至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核苷酸、C3间隔区、
磷酸、双脱氧核苷酸、氨基以及反向脱氧胸苷。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述衰减子
分子选自由以下组成的组：多核苷酸、多肽、多糖、环状分子、肽核
酸、裂褶多糖、锁核酸以及其组合。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子是可降解的。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子进一步包含位于同聚物序列5'的衔接子序列、鉴定标签序列，或两者。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中存在连接酶。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述衰减子分子是衰减子
-衔接子分子，所述衰减子-衔接子分子包含衰减子序列并且进一步包含
定位在所述衰减子序列附近并且与单独的多核苷酸上的序列X互补的
序列W；
所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与序列
V互补的序列Y，其中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相
同的长度，所述衔接子分子是与所述衰减子-衔接子分子分开的分子。
20.如权利要求17所述的组合物，其中所述衰减子分子是固定的。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子是单链的。
22.如权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中所述衰减
子分子至少部分是双链的。
23.如权利要求21至22中任一项所述的组合物，其中所述至少
部分双链的衰减子分子通过使所述衰减子分子退火到包含所述衔接子
序列的衔接子分子来产生。
24.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分
子包含选自由聚(dA)、聚(dT)、聚(dC)、聚(dG)、聚(dU)、聚(rA)、聚(U)、
聚(rC)、聚(rG)组成的组的同聚序列以及包含以下组合的杂聚序列：
(i)dA与rA碱基、
(ii)dT、dU与U碱基、
(iii)dC与rC碱基，或
(iv)dG与rG碱基。
25.如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含dU
碱基并且用dU-糖基化酶孵育使所述衰减子分子不稳定，或用dU-糖基

\t化酶孵育并且在80℃以上的温度下后续孵育使所述衰减子分子降解，
或用dU-糖基化酶与脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶的混合物来孵育所述衰
减子分子。
26.如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含核糖
核苷酸并且在对于核糖核酸酶活性充足的条件下可用核糖核酸酶降
解。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述核糖核酸酶选自由以
下组成的组：RNase H、RNase HII、RNase A以及RNase T1。
28.如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含脱氧
核糖核苷酸并且可用DNA特异性核酸酶降解。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述DNA特异性核酸酶
为DNase I。
30.一种使衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括:
在足以允许将尾部序列添加至所述衬底多核苷酸的3'末端的条件
下，用前述权利要求中任一项所述的组合物来孵育所述衬底多核苷酸；
其中所述尾部序列的所述添加允许所述尾部序列与所述衰减子分子之
间缔合来形成复合物。
31.如权利要求30所述的方法，其进一步包括在所述衬底多核苷
酸的延伸之后使所述衰减子分子降解。
32.如权利要求30所述的方法，其进一步包括在所述衬底多核苷
酸的延伸之后使所述衰减子分子不稳定。
33.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其进一步包括分

\t离所延伸的衬底多核苷酸。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其进一步包括将
权利要求1至27中任一项所述的组合物与所述衬底多核苷酸以及与所
述衰减子分子的同聚部分互补的核苷酸混合。
35.如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多
核苷酸是单链衬底多核苷酸。
36.如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多
核苷酸是双链衬底多核苷酸。
37.如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多
核苷酸是部分双链和部分单链的衬底多核苷酸。
38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述双链衬
底多核苷酸具有3'突出末端。
39.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述衬底多
核苷酸包含游离的3'羟基。
40.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中将多个核苷
酸添加至所述衬底多核苷酸。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述衰减子分子在全部或部
分衰减子分子长度上与所述尾部序列缔合。
42.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述衰减子
分子在添加所述尾部序列的过程期间与所述尾部序列缔合。
43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述衰减子
分子与所述尾部序列的缔合调节核苷酸至所述衬底多核苷酸的添加。
44.如权利要求30至43中任一项所述的方法，其中所述条件调
节所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的添加。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多
核苷酸的所述添加对温度敏感。
46.如权利要求45所述的方法，所述方法在约4℃至约50℃的温
度范围内进行。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述温度为约5℃、约6℃、
约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14
℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21
℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28
℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35
℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42
℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49
℃、约50℃。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多
核苷酸的所述添加对时间敏感。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述孵育步骤被允许进行在
约0.5分钟至约120分钟的范围内的时间长度。
50.如权利要求48或权利要求49所述的方法，其中允许所述孵
育步骤进行的所述时间长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约
7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约

\t17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、
约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约
36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、
约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约
55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、
约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约
74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、
约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约
93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约
102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约
110、约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、
约119或约120分钟。
51.如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多
核苷酸的所述添加对pH敏感。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多
核苷酸的所述添加在其中pH处于约pH 5.0至约pH 9.0的范围内的条
件下进行。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多
核苷酸的所述添加在其中pH为约pH 5.1、约pH 5.2、约pH 5.3、约pH
5.4、约pH 5.5、约pH 5.6、约pH 5.7、约pH 5.8、约pH 5.9、约pH 6.0、
约pH 6...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗拉基米尔·马卡罗夫，劳里·库里哈拉，
申请(专利权)人：斯威夫特生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US