本发明专利技术公开了一种发酵菠萝汁的制作方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵菠萝汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的菠萝汁。本发明专利技术得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的菠萝汁中，吡咯喹啉醌含量达到55-93ng/mL，纳豆激酶活力达到420-765U/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物工程与发酵领域，具体涉及。
技术介绍
纳豆由大豆经纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)发酵而成，具有多重生理功效： ①纳豆对心血管系统的作用：纳豆中一种标志性生理活性物质纳豆激酶 (Nattokinase，NK)是能够溶解血栓的蛋白质，由275个氨基酸残基组成，分子量27KD左右， 无毒、无副作用，是一种丝氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超过溶栓制剂尿激酶。纳豆激酶除 具有直接溶栓作用外，还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力，从而 间接表现其溶栓活性。纳豆中亚油酸占全脂质的50%，亚油酸能够降低血浆中胆固醇含量， 有预防动脉硬化、心脏病和高血压的功效，具有血栓溶解作用； ②纳豆对消化系统的作用：大豆蛋白质经纳豆酶的作用转化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人体吸收。Ig纳豆中含有10亿个以上纳豆菌，纳豆菌繁殖快，能消耗肠道中 的氧，可以抑制引起肠内异常发酵的痢疾杆菌等腐败菌，促进乳酸菌繁殖，调节肠内细菌平 衡，预防痢疾、肠炎和便秘等。大豆经过纳豆菌发酵蓄积了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纤维素酶和脲酶等酶群，这些生物酶在消化系统中能够有效调理促进消化吸收。纳豆芽 孢杆菌在通过分解利用大豆蛋白进行繁殖的过程中，可以产生大量酵素、维生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物质，其被覆在胃肠粘膜表面起到保护作用，饮酒时可缓解酒醉。纳豆 菌还能杀死肠道出血性大肠杆菌； ③纳豆对免疫系统的作用：通过接种纳豆菌的动物实验发现，纳豆可以提高机体 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，还可以诱发机体干扰素生成，增强机体免疫力；纳豆中含有 活性物质如皂草甙、维生素B2、维生素E等，每天食用可除去体内致癌物质，预防癌症发生， 并可软化血管，促进肌肤光滑； ④促进骨骼发育：维生素K2可促进钙与蛋白质结合从而促进骨骼形成，在骨骼形 成过程中起着重要作用，而纳豆中维生素K2含量是其他发酵食品的数百倍，有预防骨质疏 松、腰痛等老年病的功效。 近年发现纳豆还具有其它更丰富广泛的生理功效，源于其另一种标志性生理活性 物质-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是继黄素核苷酸和烟酰胺核苷 酸之后在细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，化学名称为4, 5-二氢-4, 5-二氧化-1-氢吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。虽然自然条件下仅少数细菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會泛够合成 PQQ，但在各种植物、动物以及人体内都发现含有微量PQQ。日本科学家测定了 26种常见食 物中的PQQ含量，发现1克食物中PQQ含量在3. 65-61纳克不等，例如，蔬菜中的欧芹、青椒， 水果中的奇异果、木瓜，饮品中的绿茶、乌龙茶，以及人们常吃的豆腐。值得注意的是，日本 传统食物纳豆当中PQQ含量最高，达到61纳克/克。 PQQ作为一种普遍存在于动物和植物组织中的氧化还原酶辅基，虽然含量非常低， 但作用重要，不仅是一种新发现的线粒体呼吸链组分，参与催化生物体内氧化还原反应，还 具有非常多样的生物活性，缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍，被认为是一种新型维生 素。PQQ对哺乳动物的主要生理作用有： ①全面提高人体免疫功能：PQQ作为人类发育的必要因子，能刺激人体细胞生长， 尤其是激活人体B细胞、T细胞，提高人体免疫功能； ②防治肝损伤：PQQ能显著降低血清胆红素和谷丙转氨酶水平，调理肝损伤，对肝 脏疾病有极好疗效； ③减少自由基对人体的伤害：PQQ是一种氧化还原酶辅基，参与生物体内氧化还 原反应，能有效清除体内自由基，减少自由基对人体伤害所引发的各种疾病，如心脏病、癌 症以及各类炎症； ④调理各种神经系统疾病：PQQ在体内能促进神经因子合成，调理各种神经系统 疾病； ⑤促进氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的辅基，参与呼吸链电子传递，在人体内能促 进氨基酸吸收； ⑥促进生长因子合成：生长因子是人类生长的激素，PQQ能刺激人体细胞生长，增 加细胞密度，微量PQQ就能提高生物体组织的代谢能力和生长机能； ⑦防治老年痴呆症：PQQ具有修复神经纤维、活化神经元、激活休眠神经细胞的能 力，能有效防治老年痴呆症和改善记忆力； ⑧促进谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 进机体谷胱甘肽合成，防止白内障发生和肝脏胆红素积累； ⑨极强的抗癌功能：PQQ激活自然杀伤细胞（NK)细胞为ANK细胞，使其具有杀肿 瘤作用；使NK细胞等免疫细胞聚集，更有效地杀灭肿瘤细胞；封闭肿瘤细胞载铁蛋白受体， 阻断其功能，抑制肿瘤生长、转移；破坏肿瘤细胞脂质双层，使肿瘤细胞溶解死亡；阻止肿 瘤细胞DNA复制，促其凋亡。 在天然食品中，纳豆独有NK，并且PQQ含量最丰富。纳豆中的NK和PQQ由纳豆芽 孢杆菌产生。纳豆是日常健康食品，纳豆芽孢杆菌是公认安全的食品级微生物（GRAS微生 物），对纳豆芽孢杆菌进行定向选育，然后与乳酸菌共发酵，制备富含NK和PQQ的食品，对于 人们在日常饮食中补充NK和PQQ、充分发挥NK和PQQ的生理调理作用具有重要意义。 菠萝果实品质优良，营养丰富，含有大量果糖、葡萄糖、VB、Vc、磷、柠檬酸和蛋白酶 等物质。每100克菠萝含水分87. 1克，蛋白质0.5克，脂肪0. 1克，纤维1.2克，尼克酸0. 1 毫克，钾126毫克，钠1. 2毫克，锌0. 08毫克，碳水化合物8. 5克，钙20毫克，磷6毫克，铁 0. 2晕克，胡萝卜素0. 08晕克，硫胺素0. 03晕克，核黄素0. 02晕克，维生素C8?30晕克， 灰分〇. 3克，另含多种有机酸及菠萝酶等。 菠萝性平、味甘、微酸、微潘、性微寒，具有清暑解渴、消食止泻、补脾胃、固元气、益 气血、消食、祛湿、养颜瘦身等功效，为夏令医食兼优的时令佳果；菠萝含有一种叫菠萝朊 酶的物质，能分解蛋白质，帮助消化，溶解阻塞于组织中的纤维蛋白和血凝块，改善局部的 血液循环，稀释血脂，消除炎症和水肿，能够促进血循环，尤其是过食肉类及油腻食物之后， 吃些菠萝更为适宜，可以预防脂肪沉积；菠萝有一定利尿作用，对肾炎和高血压者有益；菠 萝对支气管炎有辅助疗效；菠萝富含纤维素，对便秘治疗有一定疗效，当出现消化不良时， 吃点菠萝能开胃顺气、解油腻，起到助消化作用；菠萝富含维生素B1，能促进新陈代谢，消 除疲劳感；菠萝汁有降温作用，并能有效预防支气管炎。菠萝汁保留了菠萝的营养成分。菠 萝汁经乳酸菌发酵后，将进一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、以乳酸为主的有机酸等诸多食 疗物质。 乳酸菌发酵除能产生诸多食疗成分外，还能赋予怡人的甜酸口感。纳豆芽孢杆菌 发酵则能产生NK和PQQ。本专利技术通过选育纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌及其共发酵，开发出 富含NK和PQQ的食疗发酵菠萝汁。但如果干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌在同一体系中生长不 平衡会导致一种菌在竞争中排斥另一种，共发酵无法顺利进行。关于生理特性，即使在野生 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵菠萝汁的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑505；2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS‑Met‑；3)将纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑505和干酪乳杆菌LcS‑Met‑共发酵菠萝汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的菠萝汁。
【技术特征摘要】
1. 一种发酵菠萝汁的制作方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-505 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_ ; 3) 将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵菠萝汁，得到富 含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的菠萝汁。2. 根据权利要求1所述的发酵菠萝汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高 通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁菠萝汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG 单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽 孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜 影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变 融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量 大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大 小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆 激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。3. 根据权利要求2所述的发酵菠萝汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板 豆芽汁菠萝汁固体培养基以IL计，由以下量的组分组成：4. 根据权利要求1所述的发酵菠萝汁的制作方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中 筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其 中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D ;②将诱变 后的干酪乳杆菌涂布...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮子琦，张哲滔，莫凡，邓惟，吴渊，
申请(专利权)人：杭州元佩特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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