一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照以及序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。本发明专利技术在PCR的基础上，使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增靶序列上并且PCR上游引物在有效延伸时，报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统才能接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；且该反应始终都是闭管的实时检测可以有效防止反应产物的污染，与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于猪圆环病毒的防控和隐性带毒动物的剔除。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒
本专利技术涉及探针法实时-定量聚合酶链反应试剂盒，属于猪圆环病毒防治
，具体说是一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，本专利技术还包括该试剂盒的使用方法。
技术介绍
猪圆环病毒病是以2-型圆环病毒（Porcinecircovirustype2，PCV2）为主要病原、单独或继发/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。其感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）的发生密切相关。致死率在1%～30%之间不等(GillespieJ,etal.,2009)，患病猪的主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大、病毒血症和免疫抑制，容易继发感染如PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征)、PPV（猪细小病毒病）、猪肺炎支原体和猪链球菌等病原，造成机体多重感染。猪圆环病的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国外相继有猪圆环病毒的检测诊断试剂盒、但就目前市场供应的各种猪圆环病的抗原检测试剂盒，每头份价格在20～80元人民币之间，高昂的价格严重制约了猪圆环病实验室检测及流行病学的普查工作。目前应用相对较多的检测技术为常规的PCR方法，该方法可直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是结果的观察必须依赖于凝胶电泳，不但耗时长，而且凝胶中的溴化乙锭是一种强的致癌物，对操作人员的健康具有一定的危害；并且猪圆环病是一种具有高度传染性的病毒，其DNA（脱氧核糖核酸）特别容易发生变异。针对现有技术的不足，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格低廉的猪圆环病毒检测试剂盒。核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数同步进行，因此特异性强、灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。该技术是将常规PCR与荧光检测相结合的技术，不仅具有敏感性高、特异性强、用时短等优点，而且可通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，已成为病原体检测的重要方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确地检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，本专利技术还提供该试剂盒的使用方法。为解决上述问题，本专利技术采用了下述技术方案：一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物和序列SEQIDNO:3的探针引物的混合物。所述扩增引物序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2为：SEQIDNO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA，SEQIDNO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT。所述探针引物序列为：SEQIDNO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。所述扩增引物扩增出的条带序列为：SEQIDNO:4（218bp）：aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgct。所述阴性对照为无DNA酶水。所述阳性对照为含有PCV2基因序列的阳性质粒pGM-218；其构建方式如下：a.PCV基因组DNA的提取按QIAGENDNeasyBlood&TissueKit（凯杰公司脱氧核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作，以提取猪圆环病毒灭活疫苗基因组DNA为模板；以SEQIDNO:1及SEQIDNO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性2min；94℃变性50s,56℃退火50s,72℃延伸50s,共30个循环；72℃再延伸10min,4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；b.PCR产物的克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN（爱思进）公司的胶回收试剂盒回收，与pGMD-T-Easy克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用AXYGEN质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pGM-218。其标准曲线制作如下：对pGM-218阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1～10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。根据扩增结果从中选取5～6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。如图1所示。本专利技术还提供了所述用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：a.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94℃预变性2min；94℃20s，退火温度56℃30s，72℃20s，40个循环。b.结果分析：根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。本专利技术通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求。其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点均优于普通PCR方法。本专利技术应用分子生物学技术研制和开发出了特异性、敏感性和准确性高及价格便宜的PCV2TaqmanReal-timePCR试剂盒,一方面可以弥补我国对于PCV2检测的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。本专利技术在使用过程中无需电泳技术检测，使得检测时间由原来的3～4小时缩短到现在的1～2小时，并且避免了接触溴化乙锭的危险，有利于检测人员的健康；同时本专利技术使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增的靶序列并能被Taq酶降解时才会检测到荧光信号，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于PCV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染；本专利技术适用于待测猪的脾脏、全血、淋巴结、肉品及血清等样品，所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real‑time PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含阳性对照、序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物和序列SEQIDNO:3的探针引物的混合物，所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2为：SEQIDNO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA，SEQIDNO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT；所述探针引物序列为：SEQIDNO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物和序列SEQIDNO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测猪圆环病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，其特征在于：所述扩增引物扩增出的条带序列为：序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延长的序列；SEQIDNO:4，218bp：aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacg...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘湘涛，田宏，吴锦艳，陈妍，尚佑军，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62