一种高通量环状RNA测序的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量环状RNA测序的方法，属于分子生物学领域。该方法包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除标记上生物素的套索RNA及线性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的线性RNA，得到第四混合物；对第四混合物进行标准的高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。本发明专利技术能够准确反映出生物体内的基因在特定条件下的表达情况，降低了的成本。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量环状RNA测序的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量环状RNA测序的方法。
技术介绍
生物体内大部分的RNA为线性，但有少部分RNA首尾连接形成环状，被称为环状RNA。早在1980年，环状RNA就首次被发现，但是30年来，由于研究方法的限制，人们对于环状RNA的了解知之甚少，直至近年来，随着高通量测序技术的高速发展，并结合生物信息学的方法，大规模的转录组数据被深入挖掘，研究者们从中发现了大量的环状RNA信息，从而使得环状RNA迅速成为RNA世界研究的新热点，继而衍生出了有针对性的环状RNA测序，这也极大地加快了对环状RNA的发现及对环状RNA功能的分析。在现有的高通量转录组测序中，通过在样本中混入外源转录本作为参考，可以直接评估差异表达基因的检测的灵敏度、高通量测序文库的质量及基因表达倍数变化。研究环状RNA的前提是将环状RNA从生物体内分离出来，目前还没有直接从生物体内获取环状RNA的方法，只能从总RNA中去除线性RNA，间接达到富集环状RNA的目的。在现有的研究方法下，虽然能够对线性RNA分子进行消化，但是效果并不明显，从环状RNA的测序数据中可见，仅仅只有不到1％是环状RNA分子的序列，而其余的99％都是无用的数据。要获取足够分析环状RNA的有效数据量，单个样本的测序数据量需要达到100M，这对于高通量测序而言，仍然是个非常庞大的数字，这也意味着巨额的人力物力财力的投入。
技术实现思路
为了解决现有技术中总RNA中的环状RNA无法准确测序的问题，本专利技术实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法。所述技术方案如下：本专利技术实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法，所述方法包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，包括：选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQIDNO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQIDNO:2所示；将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA；去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并将所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端修饰羟基；对5’端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA；将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接；去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状ERCC-0013-RNA；对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对所述第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。进一步地，所述待测序样本的基因中不存在与所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。进一步地，对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制，包括：利用随机引物对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外源ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源线性ERCC-0013-cDNA和外源环状ERCC-0013-cDNA；利用第一引物和第二引物分别对所述外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量PCR扩增，所述第一引物包括如序列表中SEQIDNO:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQIDNO:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQIDNO:5所示的第二正向引物和如序列表中SEQIDNO:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于扩增所述外源线性ERCC-0013-cDNA和所述外源环状ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于扩增所述外源环状ERCC-0013-cDNA，通过所述第一引物扩增获得CT1值，通过所述第二引物扩增获得CT2值；通过CT1值和CT2值以及公式2[CT2-CT1]×100％，计算合成的所述外源环状ERCC-0013-RNA的环化比例，并选用环化比例超过90％的所述外源环状ERCC-0013-RNA。具体地，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的线性RNA。具体地，向所述待测序样本的总RNA中，加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1。进一步的，采用RNA酶R去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA。具体地，采用链霉亲和素磁珠去除被标记上所述生物素的套索RNA及所述线性RNA。具体地，所述生物学分析包括：获得所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA的相对比例、以及以所述外源环状ERCC-0013-RNA为参考分析所述待测序样本中的环状RNA基因表达变化。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法，模拟真核生物内源转录本的特征，用于评估RNA测序工具的系统性能，及基因差异表达的检测灵敏度，通过加入人工合成的外源线性RNA与环状RNA，可以为环状RNA的表达量提供一个外源环状RNA参考基因，通过外源环状RNA的表达量，可以计算样本中内源基因的表达量变化倍数，从而更准确的反映出生物体内的基因在特定条件下的表达情况；此外，通过对具有3’未端的RNA进行生物素标记，之后再利用链霉亲和素磁珠捕获被标记上生物素的RNA的方法，进一步去除线性RNA和套索RNA，提高了样品中环状RNA的富集度，减少单个样本的环状RNA测序数据量，比常用的环状RNA高通量测序方法效率提高了14倍多，大幅的降低了高通量测序的成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将结合附图对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的高通量环状RNA测序的方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的现有的环状RNA测序的方法流程图。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量环状RNA测序的方法，其特征在于，所述方法包括：人工合成外源线性ERCC‑0004‑RNA和外源环状ERCC‑0013‑RNA；对所述外源环状ERCC‑0013‑RNA进行质量控制；将所述外源线性ERCC‑0004‑RNA和所述外源环状ERCC‑0013‑RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对所述第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC‑0004‑RNA，得到第三混合物；去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。

【技术特征摘要】
1.一种高通量环状RNA测序的方法，其特征在于，所述方法包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，包括：选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQIDNO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQIDNO:2所示；将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA；去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并将所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端修饰羟基；对5’端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA；将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接；去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状ERCC-0013-RNA；对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对所述第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊飞，高利芬，陈利红，李丽丽，彭海，张继，方治伟，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42