本发明专利技术涉及外诊断试剂领域，特别是涉及一种高灵敏度的检测5’-核苷酸酶的试剂盒。本发明专利技术提供一种检测5’-核苷酸酶的试剂盒，包括5’-核苷酸酶R1试剂、5’-核苷酸酶R2试剂和5’-核苷酸酶校准品；所述5’-核苷酸酶R1试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、酶激活剂、4-AAP（4-氨基安替吡啉）、18-冠醚-6、UAO（尿酸酶）、PNP（嘌呤核苷磷酸化酶）、XOD（黄嘌呤氧化酶）和POD（过氧化物酶）反应酶系统组成；所述5’-核苷酸酶R2试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、PO3-和Trinder显色系统组成；所述5’-核苷酸酶校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂和5’-核苷酸酶组成。本发明专利技术所提供的检测试剂盒的测定灵敏度比“PNP-XOD-POD”酶系统提高了40%，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
-种高灵敏度的检测5' -核苷酸酶的试剂盒
本专利技术涉及外诊断试剂领域，特别是涉及一种高灵敏度的检测5' -核苷酸酶的试 剂盒。
技术介绍
5' -核苷酸酶（5' -Nucleotidase, 5' -NT)广泛分布肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、 垂体、甲状腺、前列腺等脏器和组织中，定位在细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状 间隙。是一种催化核苷_5'_单磷酸水解生成核苷和无机磷酸盐的酶。人血清5'-核苷酸 酶均来自胞膜，为胞外5'-核苷酸酶，其活性水平为3?12 μ mol/L磷酸。5'-核苷酸酶作 为一种糖蛋白。由两个分子量为70000的亚基组成，是含一个疏水区结构的二聚体。体内 通过糖基-磷脂酰肌醇（GPI)锚定于细胞膜外表面，它是细胞膜上二聚体解聚后形成的寡 聚体，由细胞膜上脱落并经代谢而产生广泛表达于人体组织细胞表面，包括肝细胞、成纤维 细胞、内皮细胞、淋巴细胞和神经胶质细胞、近端肾小管上皮细胞等，最适pH为6. 6?7. 0， 受Mg2+或Mn2+激活，为Ni2+所抑制。 5' -核苷酸酶（5' -Nucleotidase，5' -NT)测定主要用于肝胆系统疾病的诊断和骨 骼疾病的鉴别诊断。血清5' -NT活性升高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、近癌、肝 炎等，其活性增高可达2?6倍，且与病情严重程度呈正相关，且其活性变化与ALP -致。但 骨骼系+统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、佝偻病、甲状旁腺功能亢进等，通常ALP活性升 高，而5' -NT正常。因此ALP和5' -NT同时测定有助于肝胆和骨骼系统疾病的鉴别诊断。 同时，在肝癌患者的多次生化检测中发现，在病变早期许多生化指标升高不显著 时，5' -NT的活性便有所升高，这表明在诊断肝肿瘤时5' -NT是一个灵敏指标。另外，5'-NT 活性变化与肺癌肿瘤细胞生长、发展和转移密切相关，是肺癌核苷酸代谢中重要的转化相 关酶，监测其改变既可作为肿瘤恶变和衡量分化程度的指标，又是肿瘤生长的分子基础，因 此对发现肺癌有一定的辅助诊断作用；在检测冠状动脉病变疾病时，血清5' -核苷酸酶升 高可能在冠心病发生发展中起到一定的保护作用，对此进行干预，从而对心血管事件的发 生起到预防作用；5'-NT还在白血病、乳癌的检测中具有重要作用。 目前，临床上对5' -NT的测定方法多采用第五代PNP-X0D-P0D酶法，该方法简 便快捷、结果相对可靠，对肝胆疾患的诊断具有较高应用价值。但该方法在测定过程中，需 要PCT和Mg 2+(或Mn2+)的共同参与，由于目前许多试剂盒未能很好地解决PCT和Mg2+(或 Mn2+)生成沉淀的问题，使得测定试剂的PCT和Mg2+(或Mn2+)的浓度低于反应所需的最适浓 度，以及存在ALP对5'-IMP的干扰不能完全消除的现状，从而造成测定灵敏度低，重复性不 佳，给临床进一步推广应用次方法带来困难。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种稳定性好、测试结果 准确、灵敏度高、抗干扰能力强、重复性好，能真实反映5' -核苷酸酶的活性并能用于半自 动、全自动生化分析仪的均相测定的新方法及检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。 为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种高灵敏度的检测5' -核苷酸酶 的试剂盒，包括5' -核苷酸酶Rl试剂、5' -核苷酸酶R2试剂和5' -核苷酸酶校准品；所 述5' -核苷酸酶Rl试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、酶激活剂、4-AAP (4-氨基安替吡啉）、 18-冠醚-6、UAO (尿酸酶）、PNP (嘌呤核苷磷酸化酶）、XOD (黄嘌呤氧化酶）和POD (过氧 化物酶）反应酶系统组成；所述5' -核苷酸酶R2试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、？03_和 Trinder显色系统组成；所述5' -核苷酸酶校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂和5' -核苷酸 酶组成。 上述技术方案中，5' -核苷酸酶R1/R2试剂包含有满足第五代PNP-X0D-P0D酶 法的必要因素，同时在试剂配方中，将PCT与激活离子Mg 2+(或Mn2+)分别置于R1/R2两组分 中，避免了在试剂贮存过程中P〇3_和金属离子Mg 2+(或Mn2+)生成沉淀的问题；同时在试剂 Rl中添加组分β -甘油磷酸钠来尽可能的消除ALP水解5' -MP的干扰，可以大大提高检 测试剂的稳定性和抗干扰能力。 优选的，所述Rl试剂中还含有β -甘油磷酸钠，β -甘油磷酸钠在5' -核苷酸酶 Rl试剂中的浓度为30?60mmol/L。 上述方案中，甘油磷酸钠的浓度为底物5'-MP浓度的5倍及以上时，此时样 本中的ALP只水解β -甘油磷酸钠，对5' -IMP的水解作用很小，此时5' -核苷酸酶水解 5' -IMP基本能够代表测定样本的真实活性。 优选的，所述Rl试剂，酶组成中组分尿酸酶的浓度为1KU/L。 上述技术方案中，尿酸酶的主要作用是与反应中间产物尿酸作用，生成尿囊素的 同时生成过氧化氢，使得过氧化氢的生成量较PNP-X0D-P0D酶法而明显增大，起到放大酶 活性的作用，尤其适用于标本中5' -核苷酸酶的活性较低的情况，能够较好的解决低端的 灵敏度、精密度的问题，建立了 PNP-X0D-UA0-P0D 酶系统测定方法。 优选的，所述Rl试剂，18-冠醚-6的浓度为80mmol/L。 上述技术方案中，18-冠醚-6的主要作用是作为金属离子螯合剂，与镁离子存 在若得离子螯合作用，使得金属离子与P〇h的浓度乘积小于相应沉淀的离子积常数，而且 18-冠醚-6的结合能力又低于5' -NT与镁离子的结合能力。能够在反应过程中释放出金 属离子使之达到激活作用，同时避免了沉淀的产生。 优选的，所述试剂Rl中的缓冲液为添加有5wt%牛血清白蛋白、AEP-HBC、脂肪醇 聚氧乙烯醚硫酸钠的缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD' S缓冲液中 的一种或多种的组合；所述R2试剂中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD' S 缓冲液中的一种或多种的组合。 其中5'-核苷酸酶Rl试剂中缓冲液的浓度为20?lOOmmol/L ;5'_核苷酸酶R2试 剂中缓冲液的浓度为20?lOOmmol/L ;5'_核苷酸酶校准品缓冲液的浓度为20?IOOmmol/ L0 上述技术方案中，缓冲液的主要作用是保证配制酶法试剂盒的过程中各组分的pH 值保持在一定范围内，使整个组分的性能保持稳定，同时又能为酶促反应的进行提供适宜 的pH值，及适宜的离子强度。所述5'-核苷酸酶Rl试剂中缓冲液的浓度为20?IOOmmol/ L，pH优选为6. 8?7. 8 ;所述5'-核苷酸酶R2试剂中缓冲液的浓度为20?100mmol/L，pH 优选为6. 8?7. 8 ;所述5' -核苷酸酶校准品中缓冲液的浓度20?100mmol/L，pH优选为 6. 8?7. 8 ;这样5' -核苷酸酶Rl试剂、5' -核苷酸酶R2试剂和5' -核苷酸酶校准品中缓 冲液的加入量、PH值保持在一个适宜的范围，使各组分的酸碱度保持稳定，不会对其他物质 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测5’‑核苷酸酶的试剂盒，包括5’‑核苷酸酶R1试剂、5’‑核苷酸酶R2试剂和5’‑核苷酸酶校准品；所述5’‑核苷酸酶R1试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、酶激活剂、4‑AAP、18‑冠醚‑6、UAO、PNP、XOD和POD反应酶系统组成；所述5’‑核苷酸酶R2试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、PO3‑和Trinder显色系统组成；所述5’‑核苷酸酶校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂和5’‑核苷酸酶组成。
【技术特征摘要】
1. 一种检测5' -核苷酸酶的试剂盒，包括5' -核苷酸酶R1试剂、5' -核苷酸酶R2试 剂和5'-核苷酸酶校准品；所述5'-核苷酸酶R1试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、酶激活剂、 4-AAPU8-冠醚-6、UA0、PNP、X0D和POD反应酶系统组成；所述5' -核苷酸酶R2试剂由缓 冲液、稳定剂、防腐剂、P031P Trinder显色系统组成；所述5' -核苷酸酶校准品由缓冲液、 稳定剂、防腐剂和5' -核苷酸酶组成。2. 如权利要求1所述的一种检测5' -核苷酸酶的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂， 酶组成中组分尿酸酶的浓度为1KU/L。3. 如权利要求1所述的一种检测5' -核苷酸酶的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂， 18-冠醚-6的浓度为80mmol/L。4. 如权利要求1所述的一种检测5'-核苷酸酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中 的缓冲液为添加有5wt %牛血清白蛋白、AEP-HBC、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的缓冲液，缓冲 液为Tris-HCl缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD' S缓冲液中的一种或多种的组合；所述R2试剂 中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD' S缓冲液中的一种或多种的组合。5. 如权利要求1所述的一种检测5' -核苷酸酶的试...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉权，
申请(专利权)人：重庆中元生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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