【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善的真菌选择 对序列表的引巧 本申请含有计算机可读形式的序列表，在此将其并入作为参考。 专利
本专利技术涉及构建重组真菌宿主细胞的方法，该重组真菌宿主细胞包括一个或多个 拷贝的整合在其基因组中的多核巧酸构建体，所述方法包括；用包括编码选择性标记物的 第一多核巧酸和编码目标多肤的第二多核巧酸的整合型多核巧酸构建体对真菌宿主细胞 进行转化，其中第一多核巧酸、其5'非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在 其分支位点和其受体位点之间具有5个核巧酸或更少的剪接体内含子；W及适合的多核巧 酸构建体，生成的真菌宿主细胞及制造方法。
技术介绍
为了多肤的高产量工业制造，生物技术工业要求提供无抗生素抗性标记物的微生 物菌株，其包括若干染色体整合的目标基因的拷贝。抗生素标记物基因传统上已用作选择 携带多个拷贝的标记物基因和伴随的编码工业上关注的多肤的表达盒的菌株的手段。由于 在拷贝数和最终的产物产率之间常有直接关联，通过增加微生物制造菌株中的拷贝数对表 达盒进行扩增是所需要的。在过去20年，使用抗生素选择标记物的扩增方法已经广泛用于 许多宿主菌株，不考虑单个表达盒的表达水平，其已被证明是在相对短期内开发高产率制 造菌株的非常有效的方式。 之前已在芽抱杆菌炬acillus)中显示，从残缺的（crippled)低水平启动子表达 的编码半乳糖差向异构酶的基因可W用作串联扩增的产物基因拷贝的位点特异性基因组 整合的选择性标记物（W0 2001/90393;NovozmesA/S)。但是，对于真菌宿主细胞尚未描述 有类似系统。 核糖开关是mRNA分子的...
【技术保护点】
一种构建重组真菌宿主细胞的方法，所述重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括：a)提供用整合型多核苷酸构建体转化的真菌宿主细胞，所述构建体包括编码选择性标记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5’非翻译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或更少的剪接体内含子；b)在有益于表达所述选择性标记物的条件下培养转化的真菌宿主细胞；以及c)分离包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主细胞；优选两个或更多个拷贝；甚至更优选三个或更多个拷贝，最优选四个或更多个拷贝。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.31 EP 12170260.91. 一种构建重组真菌宿主细胞的方法，所述重组真菌宿主细胞包括一个或多个拷贝的 整合在其基因组中的多核苷酸构建体，所述方法包括： a) 提供用整合型多核苷酸构建体转化的真菌宿主细胞，所述构建体包括编码选择性标 记物的第一多核苷酸和编码目标多肽的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5'非翻 译区和/或与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个 核苷酸或更少的剪接体内含子； b) 在有益于表达所述选择性标记物的条件下培养转化的真菌宿主细胞；以及 c) 分离包括一个或多个拷贝的整合在其基因组中的多核苷酸构建体的重组真菌宿主 细胞；优选两个或更多个拷贝；甚至更优选三个或更多个拷贝，最优选四个或更多个拷贝。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优 选为枝顶孢属（Acremonium)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、烟管 菌属（Bjerkandera)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、金抱子菌属（Chrysosporium)、鬼伞 属（Coprinus)、革盖菌属（Coriolus)、隐球菌属（Cryptococcus)、Filibasidium、鎌抱 霉属（Fusarium)、腐质霉属（Humicola)、稻癌菌属（Magnaporthe)、毛霉属（Mucor)、毁 丝霉属（Myceliophthora)、新美鞭菌属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、 拟青霉属（Paecilomyces)、青霉属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、白腐 菌属（Phlebia)、Piromyces、侧耳属（Pleurotus)、裂裙菌属（Schizophyllum)、踩节 菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳属（Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)、栓菌属（Trametes)或木霉属（Trichoderma)细胞。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是酵母宿主细胞；优选为念 珠菌属（Candida)、汉逊酵母属（Hansenula)、克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces)、毕赤 酵母属（Pichia)、酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)或耶 氏酵母属（Yarrowia)细胞，例如，乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母 (Saccharomyces diastaticus) > Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母（Saccharomyces norbensis)、卵形酵母（Saccharomyces oviformis) 或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)细胞。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤（a)中的所述真菌宿主细胞具有 生长缺陷，并且所述整合型多核苷酸构建体在整合到所述宿主细胞的基因组中时弥补所述 生长缺陷。5. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤（a)中的所述真菌宿主细胞缺乏功能性的硝 酸还原酶或亚硝酸还原酶，并且所述整合型多核苷酸构建体分别包括编码功能性硝酸还原 酶的基因，例如niaD，或编码功能性亚硝酸还原酶的基因，例如niiA;或者步骤（a)中的所 述真菌宿主细胞缺乏功能性烯醇化酶，并且所述整合型多核苷酸构建体包括编码功能性烯 醇化酶的基因，例如acuN。6. 根据权利要求4所述的方法，其中在转化之后所述整合型多核苷酸构建体通过非同 源重组而随机整合在基因组中。7. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤（a)中的所述整合型多核苷酸构建体在一侧 或两侧是大小和与所述真菌宿主细胞基因组中的特异性基因座的序列同源性充足的同源 框，从而使得在转化之后所述整合型多核苷酸构建体能够通过同源重组而位点特异性地整 合到所述基因组中。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述剪接体内含子在其分支位点和其 受体位点之间具有4个核苷酸或更少；优选3个核苷酸或更少；更优选2个核苷酸或更少； 甚至更优选1个核苷酸；再更优选所述剪接体内含子在其分支位点和其受体位点之间具有 〇个核苷酸，最优选所述剪接体内含子的所述分支位点和所述受体位点重合至少一个核苷 酸。9. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述剪接体内含子包括选自以下内含 子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27、 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、 SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述整合型多核苷酸构建体的 所述第一多核苷酸具有与其可操作地连接的核糖开关；优选所述核糖开关源自米曲霉 (Aspergillus oryzae)中的 thiA 或 nmtA 基因。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述整合型多核苷酸构建体的所述 第一多核苷酸编码选择性标记物乳清酸核苷-5' -磷酸脱羧酶或PyrG。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中由所述整合型多核苷酸构建体的所 述第二多核苷酸编码的目标多肽包括酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原 酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、 几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、a -半乳糖苷 酶、￠-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、￠-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露 糖苷酶、变聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白 水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或3 -木糖苷酶。13. -种适合于转化到真菌宿主细胞中并整合到所述细胞的基因组中的多核苷酸构建 体，所述构建体包括： a) 编码选择性标记物的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5'非翻译区和/或 与其可操作地连接的核糖开关包括在其分支位点和其受体位点之间的具有5个核苷酸或 更少的剪接体内含子；和 b) 编码目标多肽的第二多核苷酸。14. 根据权利要求13所述的多核苷酸构建体，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主 细胞；优选为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟錯菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖 菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢霉属、腐质霉属、稻癌菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭 菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、Piromyces、侧耳属、裂裙菌属、踝 节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。15. 根据权利要求13所述的多核苷酸构建体，其中所述真菌宿主细胞是酵...
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