本发明专利技术提供了一种禽呼肠孤病毒培养方法，该方法利用vero细胞作为宿主细胞用于禽呼肠孤病毒增殖，其性能优异、更有利于病毒增殖，同时确定了更优的培养工艺。本发明专利技术细胞培养、病毒复制采用的设备为生物反应器，通过细胞的贴附载体，实现了细胞的悬浮培养，提高单位体积细胞的数量，从而提高病毒的产毒量。同时可对培养过程进行适时监控及定量控制，保证了生产工艺的稳定行。同时，本发明专利技术培养的鸡病毒性关节炎病毒液病毒含量高，从而制备的灭活疫苗抗原含量高，提高了灭活疫苗的效果。此外，本发明专利技术采用的生物反应器微载体增殖病毒的方式，降低了成本，节省了劳动力，增加产品的稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及。
技术介绍
禽呼肠孤病毒(ARV)能够感染鸡或火鸡并引发鸡病毒性关节炎，其具体症状包括关节炎、腱鞘炎、吸收障碍等。该病毒在商品鸡群中普遍存在，主要侵害肉鸡，也感染商品蛋鸡和火鸡，感染率可达90%以上，死亡率为5%?10%。在20世纪80年代中期证实了该病在我国的存在，近年来，鸡病毒性关节炎虽然被控制住，但是仍有发。曾有报道指出，某鸡场20日龄的雏鸡个别会出现关节肿大现象，随着病情的发展，逐渐出现跛、瘫痪、行动不便等现象，经诊断为鸡病毒性关节炎，经统计发病率高达30 %，死亡率高达8 %，其危害性非常大，给广大养禽户带来了巨大的经济损失。该病毒主要通过呼吸道和消化道传播，也可通过垂直传播，种鸡可通过孵蛋传递病毒，刚孵出的雏鸡最为易感，并迅速发生水平传播。 在免疫接种上，1日龄接种弱毒疫苗可有效地预防感染，但将影响马立克氏病疫苗的免疫效果。一般通过免疫接种灭活全病毒疫苗来控制典型的禽呼肠孤病毒感染。并且种鸡接种高抗原含量的灭活疫苗可使母源抗体对后代提供较好的保护作用，能大大促进了病毒性关节炎的防控工作。目前市场上存在几种常用的预防疫苗，弱毒疫苗占较大份额，主要采用鸡胚或鸡胚成纤维细胞的方式进行病毒增殖，由于鸡胚常携带一些外源病毒，因此在利用鸡胚或鸡胚成纤维细胞制备疫苗时存在外源病毒感染的问题，同时采用鸡胚或鸡胚成纤维细胞的方式存在成本高、工艺复杂、工作量大、批次间不稳定等缺陷。 此外，即便优选得到一种新的、性能更为优异的生产细胞，针对该细胞这种全新的生长环境采用怎样的培养条件能更加有利于病毒的增殖、获得更好的生产效率也是值得深入研究的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供，以解决现有技术中宿主细胞性能不理想，培养条件效率较低的技术问题。 为实现以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案: ，该方法是以vero细胞作为宿主细胞实施的。 优选的，包括以下步骤: 1)在容积为100?500L的反应器中以4X 105?6X 105个/ml的密度接种宿主细胞悬液进行培养，至细胞密度为2X 106?3.5X 106个/ml，得到培养液； 2)向步骤1)得到的培养液中接种禽呼肠孤病毒，进行培养； 3)收获病毒。 优选的，步骤1)接种的宿主细胞悬液是通过以下方法制备得到的:利用容积小于14L的反应器接种宿主细胞进行扩增，用细胞消化液对培养得到的培养液进行消化，得到细胞悬液。 优选的，进行消化的培养液中细胞密度不低于5X 16个/mL。 优选的，所述细胞消化液配方为:0.25%胰酶、0.53mMEDTA。 优选的，所述细胞消化液pH为7.2?7.6。 优选的，步骤I)的培养方法为搅拌式培养。 优选的，步骤I)培养过程中培养液pH为7.0?7.4。 优选的，步骤2)培养过程中培养液pH为7.2?7.5。 优选的，培养过程中培养液中具有微载体。 优选的，所述微载体的加入量为8?10g/L。 在以上技术方案中，利用vero细胞作为宿主细胞用于禽呼肠孤病毒增殖，其性能优异、更加适于病毒增殖，同时确定了更优的培养工艺，本专利技术的有益效果包括: 1、细胞培养、病毒复制采用的设备为生物反应器，结合细胞的贴附载体，可实现细胞的悬浮培养，提高单位体积细胞的数量，从而提高病毒的产毒量，同时可对培养过程进行监控及定量控制，保证生产工艺的稳定性。 2、采用本专利技术培养的鸡病毒性关节炎病毒液病毒含量高，从而制备的灭活疫苗抗原含量高，提高了灭活疫苗的效果。 3、本专利技术采用的生物反应器微载体增殖病毒的方式，降低了成本，节省了劳动力，增加产品的稳定性。 【具体实施方式】 以下将对本专利技术的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。 实施例1 (反应器微载体悬浮培养Vero细胞) 培养基:MEM血清培养基(GIBC0公司)8?10%新生牛血清 胰酶消化液:0.25%胰酶-0.53mMEDTA PBS 溶液:pH 值 7.6，含 0.02% (ff/v)EDTA 的无 Ca2+，Mg2+ 离子 转瓶培养Ve1细胞(来自于武汉大学中国典型培养物保藏中心)，当细胞长成致密单层时，细胞密度约达到2X106个/ml以上时，挑选形态健康、生长良好的单层细胞作为工作细胞，所述密度是通过将同批转瓶生产的细胞抽取一瓶制成细胞悬液来检测细胞密度，以此作为该批次的密度。 连接反应器气路管、进液管、出液管等管路，水化cytodex? I微载体(GEHealthcare)，121°C高压湿热灭菌，然后通过反应器的微载体/细胞截留装置将微载体打入反应器罐体中。同时高压液体排出，然打入新制备的细胞培养液，进行预培养备用。 将6个3L转瓶生产细胞使用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成细胞悬液，按5 X 105个/ml的细胞密度接种到B10STAT最新型生物反应器，进行培养。培养条件:细胞接种密度5X 105个/ml，工作体积4L，微载体浓度:8g/L，反应器温度:36.5?37.5°C，培养液pH:7.0?7.4，培养液溶氧:40?60%。培养过程:细胞接种24、48、72、96小时根据细胞的生长汇合情况和检测培养液中的葡萄糖含量，判断是否需换液；取样计数细胞数。培养4天，细胞密度达5X106个/ml。 实施例2 (反应器微载体悬浮培养Vero细胞-100L罐培养) 14L小规模B10STAT反应器培养Vero细胞(来自于武汉大学中国典型培养物保藏中心)，当细胞长成致密单层时，取样计数，细胞密度约达到5 X 106个/ml以上时，胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成细胞悬液，备用。 14L反应器消化过程:停止小型反应器的搅拌，使微载体自然沉降，泵出上清培养液，用pH值7.6的含有0.02 % (ff/v) EDTA的无Ca2+，Mg2+离子的PBS洗涤2?3遍，EDTA-PBS溶液使用量为反应器1个工作体积，1个工作体积是指反应器总体积的40%，然后用消化液(0.25%胰酶-0.53mMEDTA)作用。作用条件如下温度:37°C，PH值7.6，转速:60rpm，时间:20min。反应结束后加入消化时工作体积的1-2倍的细胞培养液终止胰酶的作用，即得到微载体与细胞分离开来的混合液。然后通过一个大约lOOum的对于动物细胞无毒性的筛网无菌过滤，得到细胞悬液。 连接反应器气路管、进液管、出液管等管路，在线消毒反应器。水化cytodex本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽呼肠孤病毒培养方法，其特征在于是以vero细胞作为宿主细胞实施的。
【技术特征摘要】
1.一种禽呼肠孤病毒培养方法，其特征在于是以Ve1细胞作为宿主细胞实施的。2.根据权利要I所述的一种禽呼肠孤病毒培养方法，其特征在于包括以下步骤: 1)在容积为100?500L的反应器中以4X15?6X 15个/ml的密度接种宿主细胞悬液进行培养，至细胞密度为2X 16?3.5X 16个/ml，得到培养液； 2)向步骤I)得到的培养液中接种禽呼肠孤病毒，进行培养； 3)收获病毒。3.根据权利要2所述的一种禽呼肠孤病毒培养方法，其特征在于步骤I)接种的宿主细胞悬液是通过以下方法制备得到的:利用容积小于14L的反应器接种宿主细胞进行扩增，用细胞消化液对培养得到的培养液进行消化，得到细胞悬液。4.根据权利要求3所述的一种禽呼肠孤病毒培养方法，其特征在于进行消化的培养液中细...
【专利技术属性】
技术研发人员：康亚男，李亚杰，郁宏伟，梁武，杨保收，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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