本发明专利技术公开了一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组及其应用。所述引物组包括外侧引物EB1-F3/EB1-B3和内侧引物EB1-FIP/EB1-BIP，序列如SEQIDNO:1～4所示。本发明专利技术利用该引物建立了家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测方法和试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组、2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液（或荧光染色液）、BstDNA聚合酶、密封液和无菌水。该方法检测的结果可在自然光下肉眼观察或琼脂糖凝胶电泳观察或实时荧光曲线观察判定。该方法操作简单、检测耗时短、结果易于判定，特异性强，能够检测浓度为5.0×10-3ng/μL的感染家蚕微孢子虫的家蚕所产的蚕卵DNA。
【技术实现步骤摘要】
—种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及其应用
本专利技术属于生物
。更具体地，涉及一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及其应用。
技术介绍
家蚕微粒子病是病原性的家蚕微孢子虫(Ab1SeaaN.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病，也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的经济损失十分惨重。同时，野外昆虫微孢子虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间以及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种贸易和蚕业可持续发展，我国已将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。各地区蚕业主管部门和相关生产单位投入大量人力、物力和财力，采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下的蚕种的常规方法进行防治家蚕微粒子病，但效果不佳。 最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行的，这种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，拯救了世界的养蚕业。而对于家蚕蚕卵微孢子虫的检测主要是通过将产卵24h后的蚕卵浸酸处理，待蚕卵孵化收蚁后进行显微镜检测，这种方法不仅耗费了大量时间，而且显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，且很难将其他孢子类似物与家蚕微孢子虫孢子区别开来。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病PCR检测的引物多是针对靶基因SSUrRNA的(Terry R S， Smith JE, Bouchon D, et al.Ultrastructural characterizat1n andmolecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n., a transovarially transmitted,feminizing (TTF) microsporidium.J.Eukaryot.Microb1l.1999, (46): 492-499 ；Huang We1-Fone , Tsai Shu-Jen , Lo Chu-Fang , et al.The novel organizat1n andcomplete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Geneticsand B1logy, 2004.41(5): 473-481 )。但是刘吉平等(2004)(刘吉平，曹阳，Smith J.E.等.模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究.中国农业科学，2004，37 (12):1925 - 1931)研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带及假阳性结果出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原微孢子虫基因组DNA有效扩增。2013年本实验室根据家蚕微孢子虫转录组测序的结果，经测序验证发现了家蚕微孢子虫EBl基因(登录号:KF421134.1)(专利201410279223.6)，经实验验证发现以EBl基因为靶序列设计的PCR引物检测蚕卵微孢子虫并无非特异性条带及假阳性结果，也达到了很好的检测灵敏度。但是使用该基因设计的PCR引物对于家蚕微孢子虫检测操作步骤较多，且花费时间较长，不适于野外检测等缺点，不利于实际生产上广泛地推广和使用。更大的一个问题是现有公开的检测引物均是以微孢子虫的DNA为模板，但是微孢子虫的分离和收集较复杂，耗时，极不利于大量检测或现场检测。 另一方面，微孢子虫寄生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微孢子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，如果想要直接以蚕卵DNA为模板进行微孢子虫的检测，对检测提出了更高的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有家蚕微孢子虫检测技术的不足，以家蚕微孢子虫EBl基因为靶基因设计LAMP检测引物用于检测蚕卵微孢子虫，提供一种比PCR检测方法更加简单和快速的检测方法。 本专利技术的目的是提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组。 本专利技术另一目的是提供所述LAMP检测引物的应用。 本专利技术再一目的是提供一种利用上述LAMP检测引物组建立的家蚕微孢子虫的检测方法和试剂盒。 本专利技术上述目的通过以下技术方案实现:本专利技术提供了一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组，所述引物组包括一对外侧引物EB1-F3/EB1-B3和一对内侧引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:1?4所示。 本专利技术还提供所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组在制备家蚕蚕卵微孢子虫检测试剂盒方面的应用。 本专利技术提供了一种家蚕蚕卵微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括上述外侧引物EB1-F3/EB1-B3和内侧引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1?4所示。 所述试剂盒还包括2X反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液(或荧光染色液)、fci DNA聚合酶、密封液和无菌水。 优选地，所述2 X反应缓冲液的组分如下:20mM Tris_HCl，pH8.8 ；10mM KCl ；2 mMMgSO4 ；20mM (NH4) 2S04 ；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ; IM 甜菜碱；25mM MgCl20 优选地,所述阳性对照品为EBl-DNA-pMD重组质粒；所述阴性对照品为正常家蚕DNA。 所述EBl-DNA-pMD重组质粒的制备:利用引物EBlF和EB1R，以家蚕微孢子虫DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入PMD-19T载体得到；所述引物EBlF和EBlR的核苷酸序列如SEQ ID N0:5?6所示。 优选地，所述显色液为10000XSYBR Green I或荧光指示剂IXSYBR Green I。 优选地，所述密封液为甘油。 另外，当检测结果的判定采用染色法或琼脂糖凝胶电泳法时，所述试剂盒的反应体系为: 2X反应缓冲液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ LBst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 模板DNA2 μ L ddH208.5 μ L ;当检测结果的判定采用实时荧光法时，所述试剂盒的反应体系为: 2X反应缓冲液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ LBst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 荧光指示剂0.5 μ L 模板DNA2 μ L ddH208 μ L ;其中，所述引物EB1F3/B3的浓度为5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的浓度为20?40pmol/μ L。 建议:使用试剂盒时，对于N个样品，应配制(Ν+3)倍体积的反应体系(包括阴性对照、阳性对照各一个，以及分装耗费误差)，保证各反应管分装均匀。 所述试剂盒的LAMP反应条件为:63°C恒温反应40?90 min ;然后95°C，放置2min灭活。 采用本专利技术的方法或试剂盒检测家蚕蚕卵微孢子虫的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外侧引物EB1‑F3/EB1‑B3和一对内侧引物EB1‑FIP/EB1‑BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。
【技术特征摘要】
1.一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外侧引物EB1-F3/EB1-B3和一对内侧引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:1?4所示。2.权利要求1所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组在制备家蚕蚕卵微孢子虫检测试剂盒方面的应用。3.一种家蚕蚕卵微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括一对外侧引物EB1-F3/EB1-B3和一对内侧引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1?4所示。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2X反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液或荧光染色液、Bst DNA聚合酶、密封液和无菌水。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述2X反应缓冲液的组分如下:20mMTris-HCl,pH8.8 ；10mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20mM(NH4)2S04；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ；IM 甜菜喊；25mM MgCl206.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为EBl-DNA-pMD重组质粒；所述阴性对照品为正常家蚕DNA ； 所述EBl-DNA-pMD重组质粒的制备:利用引物EBlF和EB1R，以家蚕微孢子虫DNA为模板进行PCR扩增，扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，程伟，宋小景，晏育伟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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