本发明专利技术的目的是提供一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，即通过筛选获得新型的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，并以该结构蛋白VP1作为抗原来制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。本发明专利技术中鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术利用原核表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了28kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭，免疫后可以使孵化的雏鸭获得免疫保护。
【技术实现步骤摘要】
一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫 苗。
技术介绍
鸭病毒性肝炎是由鸭甲肝病毒（Duck h印atitis A viral，DHAV)和鸭星状病毒 (Duck astrovirus)引起的一种高度致病、传播迅速的病毒性疾病，该疾病主要出现在1-3 周龄的雏鸭上，死亡率高达90%以上。而且鸭甲肝病毒呈世界范围分布，给养鸭业带来极大 的损失。 鸭甲肝病毒是小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员，主要分为3个基因型：A型、B 型和C型，对应于三个血清型DHAV-I、DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-I最早是在1950年从美 国分离得到的，是经典毒株，目前分布于世界各地，也是中国目前流行的主要毒株。DHAV-2 是分离自台湾的新型毒株，主要在台湾地区流行。DHAV-3为最早分离自韩国的新型毒株，现 在在中国大陆也有越来越多的该血清型毒株被分离得到，其与DHAV-I的混和感染往往造 成鸭肝炎疫苗的免疫失败。研究表明这三种血清型之间无交叉保护或者仅有有限的交叉保 护。 DHAV的VPl基因由714个碱基组成，编码VPl蛋白大小为26. 4kD，含有多个DHAV 抗原表位，是鸭肝炎病毒主要的保护性抗原，可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫 保护，是设计DHAV新型疫苗的首选目标基因。付玉志等（2012)通过将鸭肝炎病毒VPl基因 插入甲病毒复制子PSCAl载体中，获得重组表达质粒pSCAl/VPl，构建I型鸭肝炎病毒VPl 基因的自杀性DNA疫苗，并对其在细胞中的表达和对雏鸭的免疫保护效果进行研究，结果 表明，pSCAl/VPl不仅可以明显诱导雏鸭淋巴细胞增殖，而且可以诱导雏鸭产生较高滴度的 DHAV特异性抗体，并对雏鸭有良好的免疫保护作用。张婧等将已建立的鸭瘟病毒TK基因 缺失转移载体进行改造，在其绿色荧光表达盒内插入I型鸭肝炎病毒VPl基因，构建含有I 型鸭肝炎病毒VPl基因的重组鸭瘟病毒，并初步证实该重组病毒能够在真核细胞中正确表 达VPl基因和绿色荧光蛋白的融合蛋白，为构建鸭瘟和鸭病毒性肝炎二价基因工程疫苗的 研究奠定了基础。 但近年来我国DHAV-3导致的鸭病毒性肝炎频繁爆发，且在一些地区与DHAV-I的 共流行，表明已有的疫苗已起不到有效的保护作用。而目前国内已经批准上市的鸭病毒性 肝炎疫苗（鸭病毒性肝炎弱毒株A66株、CH60株）均为DHAV-I株，还未见DHAV-3疫苗株 出现。因此开发DHAV-3的新型疫苗株对养鸭业的健康发展无疑具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，即通过筛选获得新型 的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，并以该结构蛋白VPl作为抗原来制备鸭甲肝病毒基因工程亚 单位疫苗。 本专利技术首先提供一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ； 上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2 ; 本专利技术还提供一种鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的鸭 甲肝病毒结构蛋白VP1，其浓度为0. 1-lmg/ml之间； 本专利技术的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下： 1)将VPl基因表达载体中，构建成表达重组质粒； 2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的 重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭甲肝病毒结构蛋白VPl ; 3)对重组表达的VPl蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。 本专利技术利用pET28a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的大肠 杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 28kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯 化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭（产蛋种），免疫后可以使孵化的雏鸭获 得免疫保护。 【具体实施方式】 申请人:在获得一个具有自身免疫特性的新的鸭甲肝病毒基因的基础上，通过 pET28a(+)原核表达载体构建出能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的大肠杆菌BL21(DE3)重 组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产 方法制备出了鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗。 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。 实施例1DHAV-3的VPl基因的筛选 1、2012年5月青岛某养鸭场爆发了鸭病毒性肝炎，导致鸭场很多鸭子死亡。但爆 发鸭病毒性肝炎的鸭群已经注射过市售的鸭病毒性肝炎疫苗，因此推测致病的病原发生了 遗传上的变异，因此，选用上述的发病鸭作为样品进行致病基因的分离。 首先将发病鸭的肝脏病料用无菌生理盐水研磨，反复冻融3次，加入双抗（青链霉 素，1000U/ml)，尿囊腔接种11-13日龄的SPF鸭胚，0.2ml/枚。照蛋观察，24h内死亡者弃 去。分别取24-96小时死亡高峰期死亡的鸭胚的尿囊液、胚体，-20°C冻存，并观察死亡胚体 及肝脏有无特征性鸭肝炎症状。连传3代，分离获得毒株命名为VF-3。 2、取病变明显的毒株VF-3的尿囊液，按Trizol试剂盒的方法提取总RNA，并进行 反转录合成cDNA，以合成的cDNA作为模板进行PCR扩增DHAV-3的VPl基因，引物序列如 下： Pl:5' -cgcggatcctccaatcagcttggt-3 ' P2 :5' -aagctttta ttcaatctccagatg-3' 扩增的条件如下：94°C 5min 变性，94°C 30S，65°C 30S，72°C lmin，30 个循环，72DC 延伸lOmin。 扩增产物大小约714bp，进行测序后将VPl基因序列在NCBI上Blast比对，结果 发现与DHAV-3FX株（登录号：KF826745)的同源性最高，为95%，推导的蛋白序列同源性最 高为92%，表明毒株VF-3为发生变异的DHAV-3病毒株。其VPl基因翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO : 1。 实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得 1、上述扩增得到的VPl基因蛋白基因 BamH I和Hind III双酶切后连入pET28a 载体相应的酶切位点，构建pET28a/VPl表达载体。 2、用CaCl2法将pET28a/VP 1表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，涂布于含 50 μ g/ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵 培养至〇. 6?0. 8时加入0. 3mMIPTG诱导4?5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同 时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在28kD处多出一条蛋白条带， 与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为35%以上。经DHA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1. 一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸 序列为 SEQ ID N0:1。2. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。3. -种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。4. 权利要求1所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1基因在制备疫苗中的应用。5. -种鸭甲肝病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求3所述的 鸭甲肝病毒结构蛋白VP1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏华，
申请(专利权)人：青岛宏昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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