由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元制造技术

本发明专利技术部分基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能(DA)神经元的方法。本发明专利技术的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明专利技术还提供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的试剂和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由人多能干细胞衍生神经干细胞和多己胺能神经元 专利
本专利技术总体涉及干细胞并且更具体地涉及由人多能干细胞衍生神经干细胞和多 己胺能神经元的方法。 背景信息 人胚胎干巧巧细胞是可W分化成多个细胞类型的多能细胞。干细胞与其它细胞 类型的区别在于两个重要特征。第一，它们是有时在长期失活后，能够通过细胞分裂自我更 新的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可经诱导变成具有特定功能的组织 或器官特异性细胞。在一些器官，例如肠和骨髓中，干细胞定期分裂W修复和更换磨损或损 伤组织。然而，在其它器官，例如膜腺和也脏中，干细胞只在特定条件下分裂。 胚胎发育期间，干细胞由3大主要细胞群形成机体组织；外胚层、中胚层和定形内 胚层。中胚层产生血细胞、内皮细胞、也肌和骨骼肌及脂肪细胞。定形内胚层生成肝脏、膜 腺和肺部。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。 干细胞的潜在应用是产生用于医药疗法的细胞和组织。如今，常常将捐赠的器官 和组织用于置换患病或受损的器官和组织。不幸的是，需要移植物的人数远远超出可用于 移植的器官数量。干细胞提供了替代细胞和组织可再生源的可能性，W治疗大量疾病、病状 和残疾，包括帕金森氏症（Parkinson'Sdisease)、肌萎缩侧索硬化、脊髓损伤、烧伤、也脏 病、糖尿病和关节炎。 帕金森氏症（PD)是由黑质致密部中的中脑多己胺（DA)神经元进行性变性引起的 神经障碍。DA神经元变性引起运动系统逐步机能失调，导致例如震颤、强直和运动徐缓等症 状。对于PD而言，目前尚无治愈并且虽然治疗例如深部脑刺激和左旋多己可W减轻一些症 状，但是它们往往随时间推移而失效。然而，黑质（SN)中DA神经元损失的局部特性使得细 胞替代疗法成为有吸引力的治疗帕金森氏症（PD)患者的方法。已经证实植入神经元细胞， 例如神经干细胞（NSC)和DA神经元改善了PD动物模型中的运动症状。为了使对PD的基 于干细胞的疗法变成现实，关键是能够生成将根据在患者脑部或在培养物中是否发生终末 分化，依次在原位或在体外生成功能性DA神经元的同源NSC群体。 专利技术概述 本专利技术部分基于化学上定义的由人多能干细胞化PSC)生成神经干细胞（NSC)和 多己胺能（DA)神经元的方法。本专利技术的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本专利技术还提 供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多己胺能神经元的试剂和试剂盒。 本专利技术提供通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理人多能干细胞化PSC)并 且测定细胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞（NSC)。本专利技术还提供经由稳定的NSC期 W稳健且可重现的方式由hPSC衍生高纯度DA神经元群，其中可使用新研发的化学定向分 化法扩增和冷藏细胞。 在一个实施方案中，本专利技术提供了一种生成神经干细胞（NSC)的方法。所述方 法包括用检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞 化PSC)并且分析所述细胞的神经干细胞标志物。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另 一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomo;rphin、LD-193189或DMH-1。在特定方面，CKl抑制 剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomonhin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为 LD-193189 ;和CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。 一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。 一方面，神经干细胞标志物包括BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、 F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-UMAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6、TUBB3、SOXl、S0X2、S0X3 或 ST6GALNA巧或其任何组合。[001引 另一方面，用SB218078和DMH-I处理hPSC。所得NCS表达LMXlA和F0X2A并且为 中脑腹侧神经外胚层细胞。中脑腹侧神经外胚层细胞为多己胺能神经元的前体。 在一个实施方案中，本专利技术提供神经干细胞（NSC)。通过用检测点激酶1 (CKl)抑 制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC)并且分析所述细胞的神经 干细胞标志物生成主题NSC。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另一方面，BMP抑制剂可能 为DorsomoiiAin、LD-193189 或DMH-1。在特定方面，CKl抑制剂为SB218078 而BMP抑制 剂为Dorsomorphin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189 ;和CKl抑制剂为 SB218078 而BMP抑制剂为DMH-1。一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。 在另一实施方案中，本专利技术提供了一种生成多己胺能神经元的方法。所述方法包 括用检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC); 通过测定经处理的hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞；用至少一种多己胺能神经 元诱导化合物处理NSC并且分析细胞的多己胺能神经元细胞标志物。在某些方面，CKl抑制 剂为SB218078并且BMP抑制剂为DorsomoiiAin、LD-193189或DMH-I。在一个优选方面， CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。 在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 尸八8口7、尸0《42、尸(《04、6尸4口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、 S0X3或ST6GALNA巧或其任何组合。 在所述方法的某些方面，多己胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、k半脫 亚賴酸、犬尿唾晰酸、（时-(+)-HA-966、间氯苯基双脈盐酸盐、巧蛋白酶抑制剂、Dimaprit 二盐酸盐、8-轻基-DPAT-氨漠酸盐、反式-4-轻基己豆酸、盐酸法舒地尔、喔普醜胺、视 黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215,001盐酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺脈隆、 肯泡隆化enpaullone)、CL218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺化巧、没药留丽 (Guggulsterone)Xh55、3-MATIDA、SEW2871、Immet虹idine二氨漠酸盐、LY364947、反苯 环丙胺盐酸盐、（-)-野說碱或尼鲁米特或其任何组合。在一个优选方面，多己胺能神经元 诱导化合物为没药留丽。 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元细胞标志物可能为TUJUTH、化tJoxa2、 Nurr-I、Girk2、MAPT、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl、PINKl、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-I、LMX1A、 ENl、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITXl或V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生成神经干细胞(NSC)的方法，包括：(a)用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)；和(b)分析所述细胞的神经干细胞标志物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.24 US 61/637,797;2012.04.24 US 61/637,7841. 一种生成神经干细胞（NSC)的方法，包括： (a) 用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂处理人多能干细胞 (hPSC);和 (b) 分析所述细胞的神经干细胞标志物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组： Dorsomorphin、LD-193189 和DMH-1。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 Dorsomorphin。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 LD-193189。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 DMH-1。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述神经干细胞标志物选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、0TX2、PAX6、TUBB3、S0X1、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 或其任何组合。8. -种神经干细胞，其通过根据权利要求1所述的方法衍生。9. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078。10. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组： Dorsomorphin、LD-193189 和DMH-1。11. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为Dorsomorphin。12. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为LD-193189。13. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为DMH-1。14. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述细胞表达选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、(7^2、？4乂6、!'皿83、5(?1、5(?2、5(?3和5了6641隱05或其任何组合的神经干细胞标志物。15. -种由人多能干细胞生成多巴胺能神经元的方法，包括： (a) 用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂处理人多能干细胞 (hPSC)； (b) 通过鉴定神经干细胞标志物鉴定神经干细胞； (c) 用至少一种多巴胺能神经元诱导化合物处理NSC;和 (d) 分析细胞的多巴胺能神经元细胞标志物。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078并且所述BMP抑制 剂选自由以下组成的组：Dorsomorphin、LD-193189和DMH-1。17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂 为DMH-1。18. 根据权利要求15所述的方法，其中所述神经干细胞标志物选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、0TX2、PAX6、TUBB3、S0X1、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 或其任何组合。19. 根据权利要求15所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·冈萨雷斯，I·加里陶南迪亚，R·斯莫切肯，
申请(专利权)人：国际干细胞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US