跨越血-脑脊液屏障的肽制造技术

本发明专利技术公开了一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述肽能从血液循环中跨越血-脑脊液屏障，从而在脑脊液中富集。本发明专利技术还公开了一种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法。将本发明专利技术所述的肽作为靶向功能基可以应用于药物载体的构建，从而使药物载体富集于脑脊液，可用于脑部疾病的诊断及治疗。

【技术实现步骤摘要】
跨越血-脑脊液屏障的肽
本专利技术属于蛋白质多肽
，涉及能跨越血-脑脊液屏障的多肽，包括所述肽的分子结构及其在制备脑靶向制剂中的应用。
技术介绍
随着人类社会的老龄化，脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势，正严重危害着人类的生命和健康。通常脑部疾病包括中枢神经系统疾病(帕金森病、老年性痴呆)、脑肿瘤、脑血管病变、脑部病毒和细菌感染等疾病。血-脑屏障(BBB)是存在于血液与脑组织间的屏障系统，它能将脑组织非必需或是有害的物质隔离在外，起到保护脑组织的作用。血脑屏障上的脑毛细血管内皮细胞和胶质细胞共同构成了紧密连接，即是一道BBB的机械屏障。研究显示，脑毛细血管内皮细胞膜上还存在一些特殊的酶系统，能使某些药物降解，如多巴胺脱羧酶能使L-多巴和L-5-羟色胺酸脱羧生成不易透过BBB的L-多巴胺和L-5-羟色胺，从而构成BBB的酶屏障；脑毛细血管内皮细胞膜上的P-糖蛋白等还起着外排泵的作用，它能选择性地将脑内有害物质或过剩物质泵出脑外，限制物质的脑内递送。血脑屏障的上述功能维持了正常生理状态下脑组织内环境的恒定，但在疾病治疗过程中却限制了药物的透过。据有关统计，目前临床常规制剂给药后，大约有98％的化学药物和几乎100％的蛋白多肽或基因药物由于血脑屏障的作用而难以入脑，很大程度上限制了脑部疾病的治疗。血-脑脊液屏障(BCSFB)位于脑室脉络丛的毛细血管和脑脊液之间，其结构基础是脉络丛上皮细胞间隙的顶部有闭锁小带。脉络丛的毛细血管内皮细胞上有窗孔，并且也没有形成如BBB一般的紧密连接，因此该屏障与血脑屏障相比具有一定的通透性，这也为药物入脑发挥疗效提供的可能性。目前已有通过瞬时开放血-脑脊液屏障来增加药物入脑的策略，但该方法不具备选择性并且常具有侵入性，并且有可能导致大量潜在的神经毒素和其他化学物质进入脑内，这将对CNS的稳态产生不利影响，并产生不希望出现的副作用。相比之下，纳米载体，例如脂质体和纳米粒，可以提供更好的选择。已经有越来越多种类的纳米位和脂质体可供选择以用于治疗。这些脂质体或纳米粒的表面通常被修饰，使得该构建体可以通过特定的机制靶向中枢神经系统。筛选可以穿过血-脑脊液屏障的肽，可以帮助药物更具有选择性，从而提供更好的治疗效果，同时降低全身毒性。噬菌体展示肽库技术是一种筛选功能性多肽的生物技术，它将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，通过多轮的“亲和－洗脱－扩增”步骤，实现高通量亲和筛选。有研究通过噬菌体展示技术筛选出与内皮细胞特异性结合的多肽，其中最具代表性的是可与肿瘤血管内皮细胞特异结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列，RGD结合的长循环纳米载药系统表现出良好的肿瘤靶向性。Pasqualini等获得一种与肺细胞特异性结合的肽，通过与抗腺病毒抗体连接而靶向于细胞膜上二肽酶的递药系统。WanXiaomei等也获得一种能经鼻腔嗅粘膜入脑的七肽序列。研究显示，经噬菌体展示筛选获得的多肽亲和力高、特异性强、安全性好、生物降解和生物相容性优良、合成方便，并易于在末端进行修饰。与本专利技术相关的现有技术还有：Ito，etal.TheeffectofRGDpeptide-conjugatedmagnetitecationicliposomesoncellgrowthandcellsheetharvesting.Biomaterials,2005，26:6185；TrepelM，etal.Molecularadaptorsforvascular-targetedadenoviralgenedelivery.HumGeneTher,2000，11:1971；Xiao-MeiWanetal.Identificationofnose-to-brainhomingpeptidethroughphagedisplay.Peptides,2009，30:343。但目前为止，尚未见通过噬菌体展示技术筛选经血液循环跨越血脑脊液屏障的靶向功能基的相关研究和报道。
技术实现思路
本专利技术的一方面涉及一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，其中所述肽的氨基酸序列为TPSYDTYAAELR。所述肽是利用噬菌体展示十二肽库(Ph.D.-12TMPhagedisplaypeptidelibrary)，筛选出的能跨越血-脑脊液屏障的多肽序列。本专利技术另一方面涉及一种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法，所述方法包括i)静脉给予噬菌体随机展示肽库，随后从脑脊液中回收噬菌体；ii)将回收到的噬菌体进行扩增并再次重复i)的步骤，直至获得能跨越血-脑脊液屏障的共有肽序列。本专利技术的另一方面涉及所述肽在制备靶向制剂中的应用。所述靶向制剂如，载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束等。所述多肽可修饰于上述纳米粒、脂质体、泡囊或胶束表面，从而获得修饰由本专利技术所述肽的靶向制剂。将多肽修饰于这些制剂表面可通过静电吸附、亲和连接或共价连接等，均为本领域技术人员所熟知。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现：首先，采用噬菌体展示肽库逐轮筛选出能跨越血-脑脊液屏障的肽，其包括步骤：采用体内筛选方法，静脉给予噬菌体随机展示肽库，一定时间后，从脑脊液中回收噬菌体，扩增后再次重复一轮体内筛选过程，并进行多轮体内筛选，最终获得能跨越血-脑脊液屏障的噬菌体单克隆；测序后即可获得肽的氨基酸序列。噬菌体体内筛选方法，以及噬菌体单克隆的测序方法为本领域技术人员所熟知。所述噬菌体随机展示肽库可以是市售的噬菌体随机展示肽库，例如噬菌体展示环七肽库，噬菌体展示七肽库，噬菌体展示十二肽库，或其他适当的噬菌体展示随机肽库。所述噬菌体随机展示肽库可以静脉给予适当的动物，例如，大鼠、小鼠、兔子、狗、羊、猴、鸡等。从脑脊液中回收噬菌体可以通过抽取适当体积的脑脊液，随后与处于对数生长期的噬菌体宿主菌大肠杆菌共孵育，从而达到回收噬菌体的目的。脑脊液的抽取方法为本领域技术人员所熟知。噬菌体的回收为本领域技术人员所熟知，并将在下文中进一步详细描述。经体内外实验评价，结果证实，本专利技术所述多肽具有跨越血-脑脊液屏障并富集于脑脊液中的特性。本专利技术所述多肽可用于修饰载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束，构建成脑靶向递药系统，该递药系统能够提高药物的脑内递送，增强对于脑部疾病的治疗效果，降低全身性的毒副作用。本专利技术筛选获得的SEQIDNO:1的多肽，经过生物信息学分析比对显示，与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBankDNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术筛选得到的多肽，分子量小，生物相容性好，合成方便，成本低廉。2、本专利技术筛选得到的多肽可以用于脑部疾病靶向治疗载体的构建。附图说明图1显示了噬菌体体内筛选第一轮至第三轮筛选回收率。图2显示了经尾静脉注射后，噬菌体单克隆12-1与随机肽库噬菌体在大鼠CSF中的富集效果。图3显示了TPS肽在裸鼠体内的活体分布。裸鼠尾静脉注射FITC标记的TPS肽，以含FITC的PBS尾静脉注射给予对照组裸鼠作为对照。具体实施方式下文所述实施例是为了帮助本专利技术的内容能被更容易地理解，仅为了进一步说明本专利技术，而不意在限定本专利技术的范围。下文所述实施例中所用的缓冲液、培养基等说明如下：LB液体培养基：10g/L细菌培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能跨越血‑脑脊液屏障的肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婧炜，
申请(专利权)人：李婧炜，
类型：发明
国别省市：云南;53