用于植入的中脑多巴胺(DA)神经元制造技术

本发明专利技术涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，上述多能或多潜能干细胞可以包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞(hiPSC)以外还有的人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。具体描述了以下方法：引导hESC和/或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成大量的中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元。使用本发明专利技术的方法产生的中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、以及作为患者多巴胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记物，例如CD142和A9型神经元细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于植入的中脑多己胺（DA)神经元 政府许巧权利 本专利技术部分地在来自美国国立卫生研究所OJnitedStates化tionalInstitute ofHealth,NIH)和国立神经病学和中风研究所（^tionalInstituteofNeurological disordersandStroke,NIND巧的NIH/NINDS资助金NS052671 和NIH/NINDS资助金 P50NS047085政府资助下作出。因此，美国政府对于本专利技术具有某些权利。 专利
本专利技术涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异 性分化，上述多能或多潜能干细胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞 化iPSC)W外还有的人胚胎干细胞化ESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞 或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。具体描述了W下方法：引导hESC和/ 或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成大量 的中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元。使用本专利技术的方法产生的中脑结局 FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外 药物发现检测中的用途、神经学研究、W及作为患者多己胺神经元的疾病逆转或损伤或缺 乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神 经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记 物，例如CD142和A9型神经元细胞。 【背景技术】 保留分化成许多种特化细胞类型的能力的细胞群体可用于形成大量的谱系特异 性分化细胞群体。该些保留进一步分化成特化细胞的能力的细胞群体含有多能细胞。多能 细胞可W来源自胚胎和/或非胚胎成体干细胞。 该些谱系特异性分化的细胞群体预期应用于具有导致特定细胞群体功能丧失的 疾病的患者的细胞置换疗法中。除其直接治疗价值W外，谱系特异性分化细胞还是许多种 用途的有价值的研究工具，其包括筛选检测，W鉴定、确认和测试功能特异性，或用于测试 治疗分子的输送，W治疗细胞谱系特异性疾病。 之前使用胚胎干细胞和成体干细胞作为神经退行性疾病的治疗剂和模型系统。有 关胚胎干细胞和成体干细胞定向分化的研究和技术发展已经在中枢神经系统（CN巧疾病 领域中进行，例如，用于亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和多发性硬化。但 是，该些研究的结果表明，该些细胞用于体内使患者恢复神经功能的能力几乎没有，而且常 常导致患者中不期望的肿瘤生长。 因此，对于获得能够既用于研究且用作治疗导致具有特定功能的细胞丧失的疾病 的治疗剂的细胞群体的组合物和方法存在有需求。
技术实现思路
本专利技术涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异 性分化，上述多能或多潜能干细胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞 化iPSC)W外还有的人胚胎干细胞化ESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或 者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。 具体描述了W下方法：引导hESC和/或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细 胞，然后使用新的培养条件进一步分化成中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元的 大群体。使用本专利技术的方法产生的中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元进一步 预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、W及作 为患者多己胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分 化中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合 物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记物，例如CD142和A9型神经元细胞。 一种试剂盒，其包括第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂和第H信号传 导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子目（TGF目VActivin-Nodal(活 化素-结节蛋白）信号传导，所述第二抑制剂能够降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低用于活化wingless(Wnt)信号 传导的糖原合成酶激酶3目佑SK3目）。在一实施方式中，所述第一抑制剂是LDN-193189。 在其他实施方式中，所述第一抑制剂选自LDN-193189、其衍生物及其混合物。在一实施方 式中，所述第二抑制剂是SB431542。在其他实施方式中，所述第二抑制剂选自SB431542、其 衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述第H抑制剂是CHIR99021。在其他实施方式中， 所述第H抑制剂选自CHIR99021、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述试剂盒进一 步包括音酒因子（Sonichedgehog,SHH)信号传导的激活剂和成纤维细胞生长因子（FGF)S 受体家族信号传导的激活剂。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括脑源性神经营养因 子伽NF)、抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二下醜CAMP和目3型转化生长 因子。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自抗酪氨酸轻化酶（TH)、抗叉头框蛋白 A2(anti-forldieadboxproteinA2,F0XA2)和抗LIM同源盒转录因子Ia(LMXlA)的抗 体。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞 和工程细胞的细胞。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于分化祖细胞和中脑结局 F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神经元的说明书。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括从患 有帕金森氏病（PD)的患者获取细胞的说明书。 一种组合物，其包括与第一信号传导抑制剂和第二信号传导抑制剂接触的细胞 群体，其中大于40%的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是阳性的，其中所述细 胞群体预先与第一信号传导抑制剂、第H信号传导抑制剂和音酒因子（SHH)信号传导激 活剂接触，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子目（TGFe)Activin-Nodal信 号传导，所述第二抑制剂能够降低用于活化wingless(Wnt)信号传导的糖原合成酶激 酶3目（GSK3目）信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信号传导。在一实施方式中，所述第一抑制剂是选自LDN-193189、其衍 生物及其混合物的小分子。在一实施方式中，所述第二抑制剂选自CHIR99021及其衍生物。 在一实施方式中，所述第H抑制剂选自SB431542、其衍生物及其混合物。在一实施方式中， 所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子（SHH)C25II和平滑（SMO)受体小分子 激动剂，其中所述激动剂是purmo巧hamine。在一些实施方式中，所述细胞群体进一步预先 与成纤维细胞生长因子8(FGF8)接触。在一实施方式中，包括所述细胞群体的所述大多数 细胞是叉头框蛋白A2 (F0XA2)+LIM+同源盒转录因子1+，a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包括与LDN‑193189和CHIR99021接触的细胞群体，其中大于40％的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(FOXA2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与LDN‑193189、SB431542、音猬因子(SHH)信号传导激活剂和CHIR99021接触，其中所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂选自音猬因子(SHH)C25II和purmorphamine。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.04 US 61/555,8281. 一种组合物，其包括与LDN-193189和CHIR99021接触的细胞群体，其中大于40% 的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(FOXA2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与 LDN-193189、SB431542、音猬因子（SHH)信号传导激活剂和CHIR99021接触，其中所述音猬 因子（SHH)信号传导激活剂选自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中大于10%的所述细胞群体选自对于叉头框 蛋白A2(F0XA2)/LIM同源盒转录因子1，a(LMX1A)是双阳性的，以及对于叉头框蛋白 A2(F0XA2)/orthodenticle同源盒 2 (0TX2)是双阳性的。3. 根据权利要求1所述的组合物，其中至少20%的所述细胞群体对于选自Nurrl+、 CD142、DCSM1、CD63和CD99的标记物是阳性的。4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动 物细胞、人细胞和来自具有帕金森氏病（PD)神经系统症状的患者的人细胞。5. -种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法，包括， a) 提供： i) 细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细 胞和工程多能细胞；和 ii) 第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子（SHH)信号传导激活剂和第 三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂是SB431542,所述第二抑制剂是LDN-193189,所 述音猬因子（SHH)信号传导激活剂选自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine，并且所述 第三抑制剂是CHIR99021 ; b) 使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，其中与所述第一抑制剂 和所述第二抑制剂的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行， 使得与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发 生， c) 在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖 细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂接触； 和 d) 在使所述细胞群体与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述 细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂 的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞 群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号 传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触在能够产 生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述音猬因子 (SHH)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触为至少24小时且 至多36小时。8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述底板中脑祖细胞群体包括大于40%的叉头框 蛋白A2(F0XA2)+UM同源盒转录因子1，a(LMX1A)+细胞。9. 根据权利要求5所述的方法，还包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·施图德，JW·沈，S·克里克斯，
申请(专利权)人：纪念斯隆凯特琳癌症中心，
类型：发明
国别省市：美国;US