一种牡丹PseIF5A基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牡丹PseIF5A基因及其应用，所述牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术将所述PseIF5A基因转入烟草中表达，获得的转基因烟草在-10℃/3h冷胁迫处理后，转基因烟草植株未发生明显的形态变化，而野生型烟草出现严重萎蔫，结果显示转基因烟草比野生型烟草具有更强的耐冷性，表明本发明专利技术的牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达能显著提高转基因烟草对冷胁迫的耐性。

【技术实现步骤摘要】
-种牡丹Pse IF5A基因及其应用
本专利技术属于分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种牡丹PseIF5A 基因及其应用，特别涉及一种在牡丹中表达的PseIF5A(牡丹真核生物翻译起始因子： Paeonia suffruticosa Andr.，PseIF5A)的克隆，转基因载体的构建，烟草的转化，以及所 述牡丹PseIF5A基因在提高转基因植物的冷胁迫抗性中的应用。
技术介绍
真核生物起始因子5A(eIF5A)是真核生物中目前发现的唯一一种含有特殊氨基 酸残基-赖氨酸残基（hypusine)的高度保守性蛋白质。该赖氨酸残基是通过翻译后的两步 修饰而成，参与这两步修饰的酶分别是脱氧羧腐胺赖氨酸合酶（deoxyhypusine synthase, DHS) (EC 2·5· 1.46)和脱氧轻腐胺赖氨酸轻化酶（deoxyhypusine hydroxylase, DHH) (EC1. 14. 99. 29)。成熟的eIF5A是经过赖氨酸残基翻译后修饰才起作用。 eIF5A是最早在哺乳动物的血红细胞中被发现，因其能在体外实验中促进翻译起 始阶段第一个肽键的形成，因而被命名为翻译起始因子。然而，近期的研究发现eIF5A在 细胞内其实主要参与翻译的延伸过程。eIF5A虽然在真核细胞中高度保守且组成型表达， 然而，有研究表明敲除eIF5A基因的细胞的蛋白合成量仍能占同类正常细胞蛋白合成量的 70%，这说明eIF5A并非所有蛋白合成过程所必需的因子，而可能只是在某些特殊代谢途 径中合成蛋白所需。此外，还发现eIF5A作为一种核质穿梭蛋白，从核内向胞质中转运某些 特殊mRNAs并参与其翻译过程。 在植物中，已经克隆出eIF5A基因的物种有紫花苜蓿、烟草、玉米、番茄、水稻和拟 南芥。Wang等人（Wang T W等，Plant Mol Biol，2003)发现抑制拟南芥和番茄的DHS基因 的表达能延缓植物的衰老，这意味着eIF5A有可能参与了植物细胞的程序性死亡途径。拟 南芥中已知有三个eIF5A同源基因，其中，AteIF5A-l被证明参与植物木质部的发育过程， AteIF5A-2则在细胞的生长发育及程序性死亡过程中均发挥关键作用。然而，虽然eIF5A已 经被证明参与翻译延伸，mRNA转运以及细胞的生长发育和程序性死亡，但在高等植物中，对 其生理生化功能的研究报道仍然甚少。 牡丹（paeonia suffructicosa)是我国特有的木本名贵花舟，是中国国花，有数千 年的自然生长和两千多年的人工栽培历史。牡丹素有〃国色天香〃、〃花中之王〃的美称， 是重要的园林观赏花卉之一。随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研 究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牡丹PseIF5A基因及其应用，将该牡丹PseIF5A基因 转化烟草，可以提高转基因烟草的冷胁迫抗性。 为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案： -种牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，长度为480bp。 所述的牡丹PseIF5A基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，由 159个氨基酸残基组成，分子量为17335. 92道尔顿，pi为6. 122。 一种牡丹PseIF5A基因在提高转基因烟草的冷胁迫抗性中的应用。将本专利技术 所述牡丹PseIF5A基因的开放阅读框连接于载体pCAMBIA11300中，获得重组表达载体 pCAMBIA11300-PseIF5A，并转化农杆菌GV3101，以农杆菌浸染法（叶盘法）转化烟草叶片， 得到转基因烟草。结果显示转基因烟草（pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型烟草（CK)具有 更强的冷胁迫抗性。 在本专利技术中，术语牡丹PseIF5A基因的开放阅读框指编码完整的牡丹PseIF5A 蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-477位的核苷酸序列。 本专利技术的有益效果： 1、本专利技术首次从牡丹中克隆出如SEQ ID NO. 1所示的PseIF5A基因，在核苷酸 水平上，PseIF5A基因与葡萄真核生物翻译起始因子基因2(eukaryotic translation initiation factor5A_2_like)基因的mRNA编码序列有80%的同源性。在氨基酸水平上， PseIF5A基因与葡萄真核生物翻译起始因子基因2蛋白质的氨基酸残基有86%的相似性。 2、本专利技术将所述PseIF5A基因转化烟草得到转基因（pCAMBIA1300-PseIF5A) 烟草，对该转基因（pCAMBIA1300-PseIF5A)烟草进行-10°C/3h冷胁迫处理后，转基因 烟草植株的形态未发生明显变化，而野生型烟草出现严重萎蔫，结果显示转基因烟草 (pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型烟草具有更强的耐冷性，表明本专利技术的牡丹PseIF5A基 因在烟草中异源表达能显著提高转基因烟草对冷胁迫的抗性，可见该基因与植物的耐冷性 相关。 3、将本专利技术的牡丹PseIF5A基因转入不耐冷的牡丹品种或其它植物，可以提高转 基因宿主对冷胁迫抗性，从而为获得耐冷植物新品种或改良品质提供有用基因。 【附图说明】 图1为本专利技术的牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达提高转基因烟草的冷胁迫耐 性实验结果，其中，CK为野生型烟草，pCAMBIA1300-PseIF5A为转基因烟草。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验手册（New York :Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。 在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。 实施例1牡丹PseIF5A基因的克隆 根据葡萄eIF5A基因（登录号：XM_002285469)与沙冬青eIF5A基因（登录号： JN885967)的同源序列设计一对兼并引物：5'端兼并引物：5'-atgtcggaYgaRgaRcaYca_3'， 3'端兼并引物：5'-YtacttgggRccaatRtcctt_3'。将耐冷牡丹品种'凤丹白'的盆栽苗（五年 嫁接苗）进行41：/311低温胁迫处理，取其嫩叶提取1?隱（？1 &拉1?隱〇1^试剂盒，11&11〇2， 中国），逆转录成cDNA(逆转录的试剂盒为PrimeScript? RT Reagent Kit(TaKaRa，中国大 连））。采用RT-PCR在凤丹白中扩增出480bp条带。小量胶回收法将PCR产物进行割胶回 收，连接到pGEM T-Vector上，构建重组质粒pGEM T-PseIF5A。转化大肠杆菌DH5a，测序， 将测序结果提交至NCBI非冗余数据库进行BLAST检索。BLAST结果表明该序列和其他物种 中相应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1. 一种牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如权利要求1所述的牡丹PseIF5A基因编码的蛋白质，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋昌华，高燕，叶康，宋垚，张亚利，秦俊，奉树成，
申请(专利权)人：上海植物园，
类型：发明
国别省市：上海;31