一种用传代细胞源生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品技术

本发明专利技术提供了一种用传代细胞源生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其猪伪狂犬病活疫苗产品。该方法包括如下步骤：用传代细胞培养猪伪狂犬病病毒弱毒株；收获得到细胞培养毒液；再加入稳定剂，经冷冻真空干燥得到传代细胞源猪伪狂犬病活疫苗。使用时，还可以使用本发明专利技术制备的疫苗稀释液。本发明专利技术用传代细胞源生产猪伪狂犬病活疫苗的方法具有生产工艺简单且稳定、易操作、病毒含量高、批间差异小、质量可控、可显著提高疫苗产量和质量等优点。在常温下能保存相当长时间，尤其在2℃～8℃条件下，保存期可达36个月。使用时，使用本发明专利技术的稀释液来稀释疫苗可在常温条件下保存很长时间，依旧保持其稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种用传代细胞源生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品
本专利技术属于兽用生物制品
，更具体是涉及一种用传代细胞源生产猪伪狂 犬病活疫苗的方法及其制品。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV)引起多种动物的一种急性传染病。该传染病遍 布世界上主要养猪国家。免疫接种是防治猪伪狂犬病的主要策略。我国目前生产猪伪狂犬 病活疫苗所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞，造成批间差异较大，产毒滴度不高，给疫苗产 量、效力的提高带来了困难，而且细胞碎片与杂蛋白多，易引起过敏反应。并且半成品病毒 液的存放需要在_15°C以下保存，以免造成病毒效价的降低。 目前活疫苗常用的保护剂为明胶、蔗糖、脱脂牛奶、胰蛋白胨、EDTA、磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾等，组分复杂，各成分比例较难搭配，以致保护性能差。如果在2°C?8°C条件 下，保存期只有3?6个月，多需要在_15°C以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的 研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要 的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失败而造成疫病流行。当前，我国伪狂犬活疫苗存放温度仍 然是-15°C以下，所以耐热保护剂的研究非常急需。 现有冻干活疫苗在使用时用稀释液进行稀释时，一般是在常温下进行，需要在较 短时间进行免疫注射，避免病毒效价下降，进而造成免疫失败。现有猪伪狂犬病活疫苗通常 是用生理盐水进行稀释，稀释后在30分钟、10分钟甚至更短时间内进行免疫。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术的目的是提供一种用传代细胞源生产猪伪狂犬病 活疫苗的方法及猪伪狂犬病活疫苗产品。 为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种用传代细胞源生产猪伪狂犬病活疫苗的 方法。该方法包括如下步骤： (1)用传代细胞培养猪伪狂犬病病毒弱毒株； (2)收获病毒液； (3)加稳定剂，经冷冻真空干燥得到传代细胞源猪伪狂犬病活疫苗。 优选的，所述步骤（1)包括如下步骤： (Ia)制苗用细胞的传代与培养：所述传代细胞经胰酶细胞分散消化传代，用细胞 生长液继续培养，形成传代细胞单层； (Ib)细胞毒种的繁殖：将所述猪伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤（Ia)中得 到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；24h?44h后收获细胞培养病毒液作为生产用 毒种； (Ic)制苗毒液的繁殖：取所述步骤（Ia)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生 长液，接种所述步骤（Ib)中得到的生产用毒种，继续培养。 优选的，所述步骤（la)、（lb)、（Ic)中的细胞培养所用的温度为36°C?38°C。 优选的，所述步骤（lb)、（lc)中猪伪狂犬病病毒弱毒株接种时的接种量为1%?2% 体积百分比的生产用细胞毒种的维持液。 优选的，所述步骤（la)中的细胞生长液含90%?97%体积百分比的细胞培养液和 3%?10%体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7. 0?8. 0。 优选的，所述步骤（lb)、（Ic)中的细胞维持液含95%?99%体积百分比的细胞培 养液和1%?5%体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7. 1?7. 5。 其中所述的适合培养易增殖猪伪狂犬病毒的传代细胞的细胞培养液包括但不限 于选自MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和a -MEM培养液中 的任意一种,所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。 优选的,所述的细胞培养液为MEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清。 优选的，所述步骤（2)包括如下步骤：接毒后24h?44h收获细胞培养毒液，收获 的毒液置于Ot:以上保存。 更优选的，所述收获的毒液置于2°C?8°C条件下保存。 适合于猪伪狂犬病病毒的传代细胞包括但不限于，ST细胞系（ATCC编号： CRL-1746)、PK-15细胞系（ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系（ATCC 编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系（ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞 系（ATCC 编号：CRL-1390)、Vero 细胞系（ATCC 编号：CCL-81)、BHK-21 细胞系（ATCC 编号： CCL-10)、猪肾传代细胞系（如：IBRS-2,见例如，DECASTR0，M.P. 1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture !susceptibility of the IB-RS_2swine cell line. Arquivos Institute) Biologica 31 :63-78)、兔肾传代细胞系（RK，如：ATCC 编号： CCL-106)等传代细胞系。 优选的，所述传代细胞为猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15或猪肾传代细胞 IBRS-2。 所述猪伪狂犬病病毒弱毒株选自猪伪狂犬病病毒（Bartha K-61株)、猪伪狂犬病 病毒（Bucharest株)、猪伪狂犬病病毒（HB-98株)、猪伪狂犬病病毒基因缺失株（SA215株） 中一种或多种。 优选的，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株选自猪伪狂犬病病毒基因缺失株SA215株。 所述猪伪狂犬病病毒基因缺失株SA215株，保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2000年3月28日，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏编号为CCTCC N〇:V200002,公开于专利 CN101186902A。 本专利技术用弱毒株一词，也称减毒株。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连 续高阶继代培养实现减毒；外显基因的改变，如使已知序列中的特定核苷酸缺失或将核苷 酸插入病毒基因组中，也可能导致减毒。通过这些方法使病毒丧失致病性、但保持抗原性， 对涉及病原体基本代谢的基因进行突变来人工降低病原体毒性而得到的病毒株。 本专利技术所用活疫苗一词，指的是从已经减毒但仍可复制宿主生物体的细胞的病 毒制备的疫苗。 本专利技术的目的之二在于提供一种猪伪狂犬病活疫苗制品。 该猪伪狂犬病活疫苗制品是通过上述方法制备得到的，该制品包括稳定剂。 优选的，所述的稳定剂包括海藻糖、L-谷氨酸钠和维生素 C。 优选的，所述的海藻糖占稳定剂的比例为4%?6%W/V，所述的L-谷氨酸钠占稳定 剂的比例为4%?6%W/V，所述的维生素 C占稳定剂的比例为0. 1%?0. 3%W/V。 优选的，所述的稳定剂进一步包含聚乙烯吡咯烷酮。 优选的，所述的聚乙烯吡咯烷酮占稳定剂的比例为4%?6%W/V。 本专利技术的目的之三在于提供一种猪伪狂犬病活疫苗在用于制备预防和治疗猪伪 狂犬病病毒感染的药物中的应用。 本专利技术制备方法制备的猪伪狂犬病活疫苗制品，进一步包含稀释液，使用时，用稀 释液来稀释猪伪狂犬病活疫苗。 优选的，所述稀释液包含山梨醇和硫代硫酸钠。 优选的，所述的山梨醇占稀释液的比例为1%?3%W/V，所述的硫代硫酸钠占稀释 液的比例为1%?5%W/V。 更优选的，所述的山梨醇占稀释液的比例为I. 5%W/V，所述的硫代硫酸钠占本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用传代细胞培养伪狂犬病病毒弱毒株；（2）收获病毒液；（3）加稳定剂，经冷冻真空干燥得到传代细胞源猪伪狂犬病活疫苗。

【技术特征摘要】
1. 一种用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 用传代细胞培养伪狂犬病病毒弱毒株； (2) 收获病毒液； (3) 加稳定剂，经冷冻真空干燥得到传代细胞源猪伪狂犬病活疫苗。2. 根据权利要求1所述的一种用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤（1)包括如下步骤： (la) 制苗用细胞的传代与培养：所述传代细胞经胰酶细胞分散消化传代，用细胞生长 液继续培养，形成传代细胞单层； (lb) 细胞毒种的繁殖：将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤（la)中得到的传 代细胞单层，用细胞维持液继续培养；24h?44h后收获细胞培养病毒液作为生产用毒种； (lc) 制苗毒液繁殖：取所述步骤（la)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液， 接种所述步骤（lb)中得到的生产用毒种，继续培养。3. 根据权利要求2所述的一种用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤（la)、（lb)、（lc)中的细胞培养所用的温度为36°C?38°C ;所述步骤（lb)、 (lc)中的接种时的接种量为1%?2%体积百分比的生产用细胞毒种的维持液；所述步骤 (la冲的细胞生长液含90%?97%体积百分比的MEM液和3%?10%体积比的胎牛血清，所 述细胞生长液的pH值为7. 0?8. 0 ;所述步骤（lb)、（ lc)中的细胞维持液含95%?99%体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，田克恭，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41