一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法，属于生物技术领域。包括：1)将待转染的细胞计数并种植在多孔细胞培养板中，加入培养液，得到待转染的细胞液；2)调试等离子体射流源设备，通入基础气体，待气流稳定后，施加正弦高压电压，稳定电压直至蓝紫色等离子体气流从石英管底部吹出；3)将待转染的细胞放置在等离子体气流射流源正下方处理5～60s后，移开细胞，并加入待转染的外源核酸，混匀后放回培养箱继续培养。本发明专利技术方法可以方便地进行外源核酸的转染，而且转染后细胞死亡率比较脂质体、电转染等方法相对较低。且转染时间非常短暂，几十秒就可以完成。

【技术实现步骤摘要】
一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种转染外源核酸的方法，具体涉及一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法。
技术介绍
目前，对于转染外源DNA等核酸进入细胞有以下几种方法：1、DEAE葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。但是转染不稳定，转染效率不高。2、磷酸钙共沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛用于细胞转染的研究，先将DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA，该方法的缺点同样是转染效率不高。3、脂质体法采用阳离子脂质转染体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA和蛋白质。该方法的缺点在于，对难转染的细胞效果不好，而且脂质体细胞毒性较大，细胞死亡率较高，而且脂质体价格比较昂贵。4、电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系，该方法的缺点是细胞死亡率很高，转染仪器不好操作，溶液配制及设定参数复杂等。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法，该方法转染时间短，转染后细胞死亡率低，操作方便。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法，包括以下步骤：1)将待转染的细胞计数并种植在多孔细胞培养板中，加入培养液，得到待转染的细胞液；2)调试等离子体射流源设备，并连接气体流量计，使石英管底部距离待转染的细胞液液面1～2cm，通入基础气体，待气流稳定后，施加正弦高压电压，调整电源频率为5～20kHz，电压为7～14kv，稳定电压直至蓝紫色等离子体气流从石英管底部吹出；3)将待转染的细胞放置在等离子体气流射流源正下方处理5～60s后，移开细胞，并加入待转染的外源核酸，混匀后放回培养箱继续培养。步骤1)所述的多孔细胞培养板为24孔板，且每孔加入的细胞个数为5×105个。步骤1)所述的培养液为RPMI1640，且每孔加入300uL培养液RPMI1640。步骤2)所述的基础气体为氦气或者氩气，且调节该基础气体的气流量为2SLM。所述步骤2)在通入基础气体时还通入氧气、氮气或水蒸气作为辅助气体。调节所述辅助气体的气流量为20SSLM。所述的待转染的细胞包括肿瘤细胞及正常细胞；所述肿瘤细胞为骨髓瘤细胞LP、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMCC7721、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7或黑素瘤细胞A375；所述正常细胞为基质细胞MSC、皮肤上皮细胞Hacat或肝细胞LO2。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术利用正弦高压电源产生基础气体(如氩气)大气压冷等离子体射流，冷等离子体射流中的活性粒子可以和细胞膜作用，导致细胞膜通透性增强，外源DNA、RNA便可以进入细胞完成转染过程。本专利技术方法可以方便地进行外源核酸的转染，操作十分便捷，而且转染后细胞死亡率比较脂质体、电转染等方法相对较低，转染时间非常短暂，几十秒就可以完成。进一步地，本专利技术还可以通入辅助气体，通过调节气体配比含量，可以调控等离子体并增强转染效果。附图说明图1为产生大气压冷等离子体射流设备的结构示意图；图2为不同的等离子体转染细胞效果及其与传统的脂质体转染法进行比较的转染后荧光显微镜照片；图3为不同的等离子体转染细胞效果及其与传统的脂质体转染法荧光强度比较的柱状图；图4为本专利技术方法与脂质体转染方法转染细胞后通过流式细胞仪检测转染效果比较图；(a)、(b)为cell；(c)、(d)为lipo；(e)、(f)为Ar+H2O；图5为不同的等离子体转染细胞后的转染效率与脂质体转染后的转染效率对比结果图；图6为不同的等离子体转染细胞后的细胞活性检测与脂质体转染后的细胞活性检测对比结果图。其中，1为钨针；2为石英管盲管；3为石英管通管；4为地电极；5为等离子体。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。参见图1，本专利技术所用的等离子体射流源的中心一根钨针1为正电极，钨针1外包裹石英管盲管2，外面一圈石英管通管3。石英管上端通入Ar等基础气体。距离石英管底部3cm处，有一圈包绕的地电极4。外面均用聚氟乙烯塑封绝缘，形成一个圆柱形外壳。当管内通入惰性气体并加上正弦高压时候，石英管底部就会吹出等离子体5射流，长度可达2-3cm。本专利技术以骨髓瘤细胞LP细胞为例，进行实验：实施例1将骨髓瘤细胞LP细胞前一天换液后，细胞计数并种植在24孔板中，密度为5×105每孔，培养液为RPMI1640，每孔加入300uL培养液，作为待转染的细胞。架设好等离子体射流源，连接正负电极，并连接气体流量计，石英管底部距离细胞液面1.5cm，打开Ar气体，选择气流量为2SLM，待气流稳定后。打开示波器和高压电源。调整电源频率为10kHz，慢慢旋转高压旋钮，观察示波器上的电源电压显示，直至电压稳定在10kv后停止旋钮，固定电压。此时石英管底部就会有蓝紫色等离子体气流吹出。等待一分钟让等离子体稳定后，即可开始转染工作，将细胞放置射流源正下方并开始处理细胞，处理时间20秒之后，移开细胞，并加入待转染外源核酸，轻轻混匀后放回培养箱继续培养即可，转染工作就结束。实施例2本实施例其它操作如实施例1，区别在于：在通入基础气体时，还可以加入其它辅助气体，在Ar气开放的情况下，通过气体流量控制器加入氧气、氮气或水蒸气等气体作为辅助气体，调节各自辅助气体流量20sslm。放置1分钟待气体充分混匀并稳定后，按原来方式打开高压电源到10kv，等待1分钟后等离子体射流稳定，将待转染细胞放置射流源下方，并处理20-60秒时间后，加入待转染外源核酸，轻轻混匀后放入培养箱继续培养即可完成转染过程。具体实验验证：1、荧光显微镜检测转染效果LP细胞前一天换液后，细胞计数并种植在24孔板中，每孔加入300uL的RPMI1640培养液，细胞密度：每孔加入的细胞个数为5×105个。脂质体(lipo)转染组条件为：取2个1.5mLEP管，各加入无血清培养基50uL，一管加入3uL脂质体混匀，另一管加入2uL外源FITC荧光标记DNA并混匀，之后将两管混匀并室温放置5分钟，然后将混匀后的100uL混合液加入到待转染细胞继续培养即可。等离子体射流转染条件为：打开Ar气体，设置气流量为2SLM，如果有辅助气体，则设置辅助气体流量为20sslm，放置1分钟待气体充分混匀并稳定后，按原来方式打开高压电源到10kv，等待一分钟待等离子体稳定后，将待处理细胞放置射流底下，处理20秒后移开培养板，每孔细胞加入2uL外源FITC荧光标记DNA。转染24小时后于荧光显微镜下观察转染效果。参见图2，从给出的荧光显微镜照片中可以看到各种等离子体射流转染处理后，细胞均有荧光显示，表明经过脂质体或者等离子体转染后，外源DNA均能够进入细胞内。通过对其荧光强度分析，参见图3，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将待转染的细胞计数并种植在多孔细胞培养板中，加入培养液，得到待转染的细胞液；2)调试等离子体射流源设备，并连接气体流量计，使石英管底部距离待转染的细胞液液面1～2cm，通入基础气体，待气流稳定后，施加正弦高压电压，调整电源频率为5～20kHz，电压为7～14kv，稳定电压直至蓝紫色等离子体气流从石英管底部吹出；3)将待转染的细胞放置在等离子体射流源正下方处理5～60s后，移开细胞，并加入待转染的外源核酸，混匀后放回培养箱继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种利用大气压冷等离子体射流转染外源核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将待转染的细胞计数并种植在多孔细胞培养板中，加入培养液，得到待转染的细胞液；2)调试等离子体射流源设备，并连接气体流量计，使石英管底部距离待转染的细胞液液面1～2cm，通入基础气体，待气流稳定后，施加正弦高压电压，调整电源频率为5～20kHz，电压为7～14kv，稳定电压直至蓝紫色等离子体气流从石英管底部吹出；所述的基础气体为氦气或者氩气，且调节该基础气体的气流量为2SLM，且在通入基础气体时还通入氧气、氮气或水蒸气作为辅助气体，调节所述辅助气体的气流量为20SSLM；3)将待转染的细胞放置在等离子体射流源正下方处理5～60s后，移开细胞，并加入待转染的外源核酸，混匀后放回培养箱...

【专利技术属性】
技术研发人员：许德晖，杨延洁，王碧菁，孔刚玉，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61