本发明专利技术属于生物技术领域，涉及涉及一种虎杖毛状根的诱导及利用生物反应器扩大培养的方法，具体为一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法。本发明专利技术以虎杖植株野生带芽茎段为外植体，成功诱导出虎杖组培苗，并建立了虎杖组织培养体系，并成功诱导出虎杖毛状根体系，且建立了虎杖毛状根生产白藜芦醇体系，成功通过气升式生物反应器使虎杖毛状根生产白藜芦醇，并对白藜芦醇进行了含量测定及提取分离。通过虎杖毛状根生产白藜芦醇，与现今生产方式相比，具备在无激素培养基上快速生长的特性。因此该方法操作简单、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点，为今后进行工业化生产提供了可靠地来源和物质基础。
【技术实现步骤摘要】
一种虎杖毛状根生产白黎芦醇及扩大培养的方法
本专利技术属于生物
，涉及涉及一种虎杖毛状根的诱导及利用生物反应器扩 大培养的方法，具体为。
技术介绍
白藜芦醇（Resveratrol, 3,4 ' ，5-trihydroxy-trans-stilbene)即反式 3, 4'，5-三羟基芪，为二苯乙烯类化合物，以游离态和糖苷结合态两种形式存在于虎杖、 葡萄、花生等多种植物中，其中以虎杖中含量最为丰富。是一种重要的植物抗毒素。白藜芦 醇具有多种药理活性，如抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病毒活性等，能修复非 典型肺炎方剂所致的细胞DNA损伤，尤其对人类健康的大敌一肿瘤和心脏病的治疗和预防 有明显的作用。 虎杖为寥科虎杖属多年生草本植物，是我国传统中药材，广泛分布于华东、中南 及陕西、甘肃、四川等地，虎杖提取物具有抗炎、预防心血管疾病等多种药理活性，主要活 性成分为白藜芦醇和大黄素。据统计,虎杖再生量为9. 8*106kg/年，其可持续采挖量为 4. 95*106kg/年，市场需求量为6. 0*106kg/年。因此，虎杖的野生资源已面临过度采挖的局 面。而据统计提取1吨白藜芦醇需要消耗500吨虎杖原料，但白藜芦醇在植物体内含量普 遍较低。 为解决药用植物的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽 培的药用植物中，一些药用植物生产周期很长，若以常规方法育种或育苗，需要花费较长时 间。还有一些药用植物因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加。另外 一些药用植物，则因病毒危害导致退化，严重影响了产量和品质。为保证药用植物资源的可 持续利用，利用生物工程的途径对珍贵资源进行细胞或组织培养、有效成分的关键基因克 隆与转化等技术，可能是解决中药产业化的有效途径。于是，积极研究药用植物资源的再生 技术，使有限的资源为人类持续利用迫在眉睫。而毛状根技术具有生长快速、不需外援植物 激素、合成次生代谢物能力强而稳定、不受季节和时间限制等优点。而Ri质粒转化的毛状 根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物代谢产物的工业 化生产提供了广阔前景。 目前据报道虎杖已成功诱导毛状根，李卓玺等诱导虎杖毛状根中白藜芦醇的含量 为8. 21mg/kg ;于树宏等探讨影响虎杖毛状根高频诱导的因素，结果表明成熟叶片是转化 率较高的外植体，感染IOd左右可形成毛状根，平均诱导率为55. 66%，诱根密度为4. 30 ; 而苗晓燕等对虎杖毛状根DNA提取方法进行了研究，结果表明改良CTAB法解决了虎杖富含 多酚、多糖等类物质难以提取高质量DNA的问题，提取的DNA质量较好，纯度较高。而于树 宏等为虎杖毛状根制备虎杖苷进一步申请了专利，专利号为200510012809. 7,但目前只是 停留在实验阶段，还未有进一步进行产业化方面的研究。目前，利用虎杖毛状根生产白藜芦 醇已有报道，但利用生物反应器进行虎杖毛状根生产白藜芦醇产业化方面还未见报道。因 此，利用虎杖毛状根生产白藜芦醇，特别是通过生物反应器进行产业化，对解决药用植物次 生代谢产物白藜芦醇的工业化生产提供了的一条有效途径，对解决虎杖资源现状具有重要 意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，并通过 虎杖组织培养技术、毛状根培养技术及生物反应器来大量生产白藜芦醇，从而替代野生资 源，为白藜芦醇的生产提供一条有效的新途径。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案： -种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，该方法包括以下步骤： (1)外植体1的消毒 取野外虎杖带芽茎段自来水流水冲洗3h，在超净工作台中酒精浸泡60s，无菌水 冲洗3-5遍，0. 1 %升萊浸泡5-8min (根据材料老嫩程度而定），无菌水冲5-6遍，用灭菌过 的滤纸吸干水分，备用。 (2)虎杖组培苗的诱导与继代培养 将步骤（1)中所选用外植体1切成I. 5cm带芽茎段接种于MS+6-BA2. 5mg/ L+NAAO. 5mg/L，带长至 30d 后继续继代培养，选用 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/ L+TDZO. 05mg/L，培养条件：温度25±2 °C，采用日光灯，光照1500-20001ux，光照时间 14-16h。每25-30天继代一次，继代2- 3次后待长出健壮、发育良好的完整虎杖组培苗备 用。 ⑶虎杖毛状根的诱导 1)预培养 将步骤⑵中获得的组培苗叶片（带叶柄，I. 0cm*l. Ocm)或茎（I. 5cm)，转接至MS 空白培养基中暗培养2天，培养温度25 ± 2°C。 2)发根农杆菌的活化 将发根农杆菌ATCC15834(由广东省林业科学研究院生物技术研究所馈赠）在YEB 固体培养基中活化，挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，在28°C，120r ^mirT1和黑暗条 件下振荡培养20h，使其达到生长对数期，以感染虎杖外植体2,测定其OD值为0. 2-0. 5。 3)侵染与共培养 将经过预培养的外植体2(叶片或茎）转移至已活化好的农杆菌菌悬液中，浸染 lOmin。然后用无菌滤纸吸取外植体2表面多余的菌液，将其接种于MS空白培养基+乙酰 丁香酮（AS) 20-50mg/L，于25°C黑暗条件下共培养2d。 4)除菌及优化培养 将步骤3)中共培养2天的外植体2开始除菌，用无菌水冲洗3次，转移至MS+头 孢噻]3亏钠（cefotaxime)500mg/L培养基中（即除菌培养基），25°C，14h · (Γ1散射光下进行 除菌培养。每5d转接一次，反复继代除菌，直到培养基无菌斑出现。将诱导出的虎杖毛状 根继续在1/2MS空白液体培养基中继续继代增值2-3次。 (4)虎杖毛状根PCR检测 将步骤4)中获得的虎杖毛状根进行DNA提取，获得含有RolB和tms基因反应体 系，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。RolB的扩增条带大小为422bp，tms的 大小为910bp。 (5)虎杖毛状根的根系优选及生物反应器的扩大培养 将经PCR检测出的毛状根，且挑选除菌彻底，分枝多，生长快的毛状根剪成长 l-3cm，在IL气升式生物反应器中加入1/2MS空白液体培养基加入3%蔗糖、酸水解酪蛋白 〇-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求全 部无菌，PH5. 8 - 6. 5,温度：25±2°C，暗培养，通气量为0. 05vvm，当毛状根生长达到对数期 时,称取湿重、干重。 (6)虎杖毛状根中白藜芦醇HPLC的含量测定 将经HPLC含量检测虎杖毛状根中白藜芦醇的含量表明，虎杖毛状根中白藜芦醇 的含量为210-280 μ g/g，白藜芦醇苷为1500-2340 μ g/g。 (7)白藜芦醇的提取分离纯化 将步骤（5)中虎杖毛状根干燥，粉碎，加蒸馏水（pH = 10)搅拌、过滤，将滤渣再次 浸提，过滤，合并滤液，调PH为弱酸性。将粗品用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱 层析。将含有白藜芦醇的层析产物用适量乙醇反复结晶后，50°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）植物材料的选取与处理选取野生虎杖带芽茎段切成2‑4cm的小段为外植体1，并对其进行消毒处理；（2）植物组培苗的诱导 将步骤（1）中外植体1接种于诱导培养基上，在温度为25±2℃，光照强度1500‑2000lux，光照时间14‑16h，在25天后，将其虎杖诱导芽进行继代培养；（3）组培苗继代培养 将步骤（2）中获得的诱导芽接种于继代培养基中，继续继代培养，培养条件同步骤（2）；待叶片完全张开，长至成熟组培苗后用于虎杖毛状根的培养；（4）虎杖毛状根的诱导及继代培养将步骤（3）中获得的成熟组培苗叶片或茎作为外植体2用于虎杖毛状根诱导；具体步骤如下：a、外植体2的预培养：将叶片或茎在MS空白培养基中暗培养两天；b、菌种活化：发根农杆菌在YEB培养基中活化；c、共培养：将活化后的发根农杆菌与虎杖叶片、茎侵染10‑30min后，放置MS空白培养基中暗培养两天；d、除菌培养：将共培养后的叶片或茎在含有头孢噻肟钠或卡那霉素或羧苄西林钠的MS空白培养基中除菌培养，直到除菌完全；培养条件：温度为25±2℃，暗培养，每3‑6天除菌一次，直到除菌完全；e、继代培养：将除菌完全长出毛状根0.1‑0.5g接种于1/2MS空白液体培养基中进行继代培养2‑5次，每20天继代培养一次，均在25±2℃的条件下培养；（5）虎杖毛状根PCR检测DNA提取：提取虎杖毛状根DNA；PCR体系：获得含有rolB和tms引物的PCR体系；采用琼脂糖凝胶电泳获得目标条带；（6）生物反应器大规模培养虎杖毛状根在1L气升式内环流发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基，另加入3%蔗糖、酸水解酪蛋白0‑‑5g/L、黑曲霉0‑‑100mg/L、L‑苯丙氨酸0‑‑50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求全部无菌，pH 值为5.8—6.5，温度：25±2℃，暗培养，通气量为0.05vvm条件下进行培养，在培养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变；（7）虎杖毛状根的提取分离；（8）采用HPLC测定虎杖毛状根中白藜芦醇的含量。...
【技术特征摘要】
1. 一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于该方法包括以下步 骤： (1) 植物材料的选取与处理 选取野生虎杖带芽茎段切成2-4cm的小段为外植体1，并对其进行消毒处理； (2) 植物组培苗的诱导 将步骤（1)中外植体1接种于诱导培养基上，在温度为25±2°C，光照强度 1500-20001ux，光照时间14-16h，在25天后，将其虎杖诱导芽进行继代培养； (3) 组培苗继代培养 将步骤（2)中获得的诱导芽接种于继代培养基中，继续继代培养，培养条件同步骤（2); 待叶片完全张开，长至成熟组培苗后用于虎杖毛状根的培养； (4) 虎杖毛状根的诱导及继代培养 将步骤（3)中获得的成熟组培苗叶片或茎作为外植体2用于虎杖毛状根诱导；具体步 骤如下： a、 外植体2的预培养：将叶片或茎在MS空白培养基中暗培养两天； b、 菌种活化：发根农杆菌在YEB培养基中活化； c、 共培养：将活化后的发根农杆菌与虎杖叶片、茎侵染10_30min后，放置MS空白培养 基中暗培养两天； d、 除菌培养：将共培养后的叶片或茎在含有头孢噻肟钠或卡那霉素或羧苄西林钠的 MS空白培养基中除菌培养，直到除菌完全； 培养条件：温度为25±2°C，暗培养，每3-6天除菌一次，直到除菌完全； e、 继代培养：将除菌完全长出毛状根0. 1-0. 5g接种于1/2MS空白液体培养基中进行继 代培养2-5次，每20天继代培养一次，均在25 ±2°C的条件下培养； (5) 虎杖毛状根PCR检测 DNA提取：提取虎杖毛状根DNA ; PCR体系：获得含有rolB和tms引物的PCR体系； 采用琼脂糖凝胶电泳获得目标条带； (6) 生物反应器大规模培养虎杖毛状根 在1L气升式内环流发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基，另加入3%蔗糖、酸水解酪蛋 白0-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求 全部无菌，口11值为5.8-6.5，温度：25±21：，暗培养，通气量为0.05^111条件下进行培养， 在培养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变； (7) 虎杖毛状根的提取分离； (8) 采用HPLC测定虎杖毛状根中白...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪汉君，熊小灿，
申请(专利权)人：成都市三禾田生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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