高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种高度糖基化并在体内高度长效的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，以及涉及其制备方法。更具体地，本发明专利技术涉及长效人生长激素NexP-hGH蛋白的具体同种型，其中人生长激素与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，从而增加体内长效性能，并涉及其生产方法。在考虑持续性人生长激素产生方法的范围内，本发明专利技术也涉及用于NexP-hGH的高纯度纯化方法，该方法具体包含以下步骤：(a)对包含其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合的长效人生长激素NexP-hGH的生物乳液进行阴离子交换树脂色谱；(b)对该包含NexP-hGH的生物乳液或步骤(a)中产生的洗脱物进行疏水树脂色谱；和(c)对该包含长效人生长激素NexP-hGH的生物乳液和步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物进行亲合色谱，该亲合色谱装填了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在体内被高度糖基化并高度长效的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，及其制备方法。更具体地，本专利技术涉及长效人生长激素NexP-hGH蛋白的一种具体同种型，其中人生长激素与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，及其制备方法。该长效人生长激素的制备方法也涉及一种高纯度纯化NexP-hGH的方法，具体地包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；(b)将包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和(c)将包含该长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。
技术介绍
通常，天然型人生长激素(hGH)由191个共具有约21500道尔顿的分子量的氨基酸组成。人生长激素从垂体前叶分泌，并且在体内促进骨和软骨生长。生长激素缺乏可造成身材矮小、增加心血管疾病的风险、降低肌肉和骨密度等。为治疗生长激素缺乏，源自人脑下垂体或通过遗传工程技术生产的生长激素自20世纪50年代起被使用，全球人生长激素市场在2009年已达到约3万亿韩元。然而，上述生长激素存在缺点，因为它们必须通过每天皮下注射给药，因而存在改善和增加患者依从度的需求。为满足此需求，开发了长效人生长激素，并且为改善其长效性能，使用了缓释制剂和诸如与蛋白质或糖类融合、糖基化技术等的改造。例如，2007年，Genetech公司(Genentech Inc.)推出了作为第一种缓释人生长激素产品的NutropinLG生命科学公司(LG Life Sciences LTD.)(韩国)推出了Declage(韩国专利号10-0236771和10-0329336)。然而，缓释治疗仍有问题，因为它们在体内引起不希望的免疫应答、由于使用相当厚的注射器针导致疼痛并具有低产量。特别地，由于与其他第一代产品相比的低效力，Nutropin退出了市场。为改善除了缓释制剂之外的蛋白的持续活性，可使用诸如与聚乙二醇融合成聚合物糖(Sada等人，发酵生物工程杂志71,137-139,1991)(Sada et al.,J.Ferment Bioeng 71,137-139,1991)、糖基化改造(美国专利号7,217,689)和与其他蛋白质融合(WO 93/15199)的方法以促进体内吸收、代谢和排出。然而，上述方法未被用作常规的增加半衰期的方法，这是由于各种原因，包括由于低产量的低成本效益、长期使用中引起免疫应答、缀合中使用的化学物质的毒性等。因此，存在用改善其长效性能同时最小化上述问题的方法开发长效人生长激素的需求。韩国专利号10-1183262公开了以作为体内蛋白的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体和人生长激素之间的缀合物的形式开发长效人生长激素蛋白，尝试通过蛋白尺寸增加改善半衰期。此外，韩国专利申请公开号10-2013-0029713公开了通过α-1抗胰蛋白酶上至少一个突变加入N-糖基，尝试增加体内半衰期的方法。本专利技术人使用的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突变体是其中特定氨基酸被突变以移除α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的固有体内活性，同时增加其半衰期的突变体。其作为蛋白酶抑制剂的固有活性被移除的α-1抗胰蛋白酶的蛋白质序列及其制备方法在韩国专利申请公开号10-2010-01165中公开。长效人生长激素是融合蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体通过遗传重组与人生长激素的N端或C端融合，是与第一代人生长激素相比具有改善的半衰期的材料。该长效人生长激素被制备，使得它在CHO细胞中表达以被糖基化，而大部分第一代人生长激素药物是在大肠杆菌(E.coli)中生产的。α-1抗胰蛋白酶的纯化是通过用聚乙二醇和pH(EP专利号0097274)以及阳离子交换树脂(EP专利号96929430和95112630)将杂质选择性沉淀而常规进行的。此外，第一代人生长激素通常是通过在大肠杆菌中以包涵体的形式过表达，然后重折叠并用阴离子交换树脂纯化制备的(韩国专利1998-0003752和Patra AK,Mukhopadhyay R,Mukhija R,Krishnan A,Garg LC,Panda AK.(2000)18,182-192,200；蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif.))。同时，该长效人生长激素NexP-hGH是一种具有约70至90kDa的分子量的新材料，它与第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶在生理化学性质方面例如分子量、等电点、多糖模式等不同，具有高纯度的长效人生长激素不能由与用于第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶的相同/相似的纯化方法获得。此外，该长效人生长激素的纯化方法在专利或科学文献中未被公开。在此情况下，在致力于发现其高纯度尚未被认为可能的长效人生长激素的有效纯化方法时，本专利技术人发现高纯度长效人生长激素可通过阴离子交换树脂、疏水树脂、附着抗体片段的树脂等获得。此外，体内存在的蛋白的糖基化水平对半衰期和效力的影响程度多种多样，这取决于蛋白的类型，例如常规使用的蛋白药物促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子(GCSF)。促红细胞生成素——一种存在于体内的蛋白——的体内效力取决于其唾液酸含量而改变(JCEgrie和JK Browne，英国癌症杂志(British J.of Cancer)，84,3-10,2001)。具体地，促红细胞生成素在唾液酸含量和体内效力之间具有高度相关性，含有预定比例或更高的唾液酸含量的高度糖基化的多糖显示适当的效力。相反，取决于多糖的存在/不存在，GCSF的效力在体外效力方面显示了高达25％的差异，但在体内效力方面没有差异(H Bonig等人.骨髓移植(Bone marrow transplantation)，28,259-264,2001)。因此，在致力于开发在体外和体内条件下都显示长效药物学活性，同时具有较低的免疫原性风险的人生长激素时，本专利技术人发现具有特定pI的NexP-hGH蛋白的一个同种型在上述在动物细胞中产生的蛋白中具有卓越的体内长效效果和生长效果，因而完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术是在考虑了现有技术中发生的上述问题后作出的。本专利技术的一个目的是提供一种在动物细胞中产生的长效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP‑hGH蛋白，其中α‑1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更低的等电点(pI)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.05 KR 10-2012-0060641;2013.05.31 KR 10-2011.一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其
中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有
5.2或更低的等电点(pI)。
2.权利要求1所述的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中所述
α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)包含至少一个选自下述的突变：野生型
α-1抗胰蛋白酶蛋白第9个残基上谷氨酰胺至天冬酰胺的突变、野生型
α-1抗胰蛋白酶蛋白第232个残基上半胱氨酸至丝氨酸的突变、野生型
α-1抗胰蛋白酶蛋白第357个残基上脯氨酸至天冬氨酸的突变和野生型
α-1抗胰蛋白酶蛋白第359个残基上丝氨酸至苏氨酸的突变。
3.一种制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，所述方法包
括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶
突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填
充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及
(b)根据等电点(pI)差异分离具有5.2或更低的等电点(pI)的所
述长效人生长激素NexP-hGH蛋白。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤(b)包括用含0至1000mM 
MgCl2的Tris缓冲液洗脱所述长效生长激素NexP-hGH蛋白。
5.权利要求4所述的方法，其中所述Tris缓冲液包含200mM 
MgCl2。
6.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效
人生长激素NexP-hGH蛋白的样品施加到阴离子交换树脂色谱或疏水
树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体
片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。
7.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效
人生长激素NexP-hGH蛋白的样品依次施加到阴离子交换树脂色谱和
疏水树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶
抗体片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。
8.根据权利要求3至7任一项制备的长效人生长激素NexP-hGH蛋
白。
9.一种纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与
α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色
谱；
(b)将所述包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗
脱物施加到疏水树脂色谱；和
(c)将所述包含长效人生长...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜佶扶，李庭旼，安智远，李东亿，田昌奉，李元祯，赵诚唯，朴芝彗，金起完，李允庭，文智铉，吴厚根，朴映准，李尙贤，林亨泽，朴淳宰，郑惠信，李尙美，
申请(专利权)人：CJ医药健康株式会社，阿特根公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR