【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,特别涉及一种不仅适用于Cre-LoxP系统,又携带EF1α启动子驱动的EGFP及Puro双报告基因,同时携带CMV启动子驱动的人工合成的多克隆位点的慢病毒表达载体及其构建与应用。
技术介绍
慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒(human immune-deficiency virus,HIV)为基础改造而来,具有宿主范围广,能感染分裂细胞及非分裂细胞,转染效率高,能携带多达8~10kb的外源基因等优势,是基因功能研究及基因治疗领域的重要途径之一。近年来,随着分子生物学技术的深入发展,根据慢病毒载体的物理特性将其分装到几个不同的质粒中,进一步提升了慢病毒载体用于基因治疗的安全性。这种技术改进不但使得慢病毒载体所携带的外源基因有效整合到宿主细胞的基因组并稳定表达,同时又具有较低的免疫原性,进而能有效降低慢病毒载体作为基因治疗手段的潜在风险。而且,与逆转录病毒载体相比,慢病毒载体通过随机整合的方式将外源基因插入到宿主细胞的基因组中,因此不容易造成原癌基因及致癌基因位点的插入突变。目前,基于慢病毒载体的基因转染已经在造血干细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞中取得成功,从而为有关免疫细胞相关疾病的基因治疗提供了一条有效途径。而且,慢病毒载体系统在肿瘤基因治疗领域同样显示出良好的应用前景。2006年,Levine等进行了第一项基于慢病毒载体的人体临床实验,利用表达 ...
【技术保护点】
一种基于Cre‑LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P,其特征在于:该慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P是以慢病毒载体pLOX‑TERT‑riesTK为基础,通过插入多克隆位点构建pLOX‑MCS载体,同时在入多克隆位点末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段,进而构建慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P;所述载体pLOX‑CMV‑E/P所携带的多克隆位点由CMV启动子驱动,所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。
【技术特征摘要】
1.一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在
于:该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为
基础,通过插入多克隆位点构建pLOX-MCS载体,同时在入多克隆位点末端引
入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段,进而构建慢病毒表
达载体pLOX-CMV-E/P;所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV
启动子驱动,所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。
2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在于:
所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、
EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在
于:所述的多克隆位点的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1~3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方
法,其特征在于包含以下步骤:
(1)设计合成两条引物,分别见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3;
(2)将上述两条引物等量混合,进行退火反应,以形成DNA双链,进而
获得人工合成多克隆位点序列MCS;所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI
及KpnI酶切位点的粘性末端;
(3)将经过SpeI和KpnI双酶切的pLOX-TERT-iresTK质粒DNA片段,与
步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接,构建pLOX-MCS载体;
(4)设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R,以
pB513质粒为模板,PCR扩增EF1α-EGFP-Puro片段;
(5)将步骤(4)所述的PCR扩增产物及步骤(3)所述的pLOX-MCS载体
均使用BamHI和KpnI双酶切,然后进行连接反应,将EF1α-EGFP-Puro片段插入
到pLOX-MCS载体多克隆位点中的BamHI与KpnI...
【专利技术属性】
技术研发人员:齐绪峰,夏景波,陈卓莹,蔡冬青,吴彩红,王健欢,毛承舟,刘光辉,
申请(专利权)人:暨南大学,
类型:发明
国别省市:广东;44
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