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慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用制造技术

技术编号:11072169 阅读:161 留言:0更新日期:2015-02-25 11:33
本发明专利技术公开一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用。所述载体在CMV启动子下游插入多克隆位点,能够被SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI共7个限制性内切酶所识别。所述载体的应用包括:将目的基因插入到多克隆位点,实现目的基因的稳定表达;利用EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因进行荧光示踪及抗药性筛选;利用已在3′LTR区域插入的LoxP位点及慢病毒的转录与反转录特性,在Cre重组酶表达的情况下实现外源基因及报告基因的有效删除。本发明专利技术的载体可通过与pCMVR8.74及pMD2.G载体共同转染293T细胞,实现慢病毒颗粒的包装。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,特别涉及一种不仅适用于Cre-LoxP系统,又携带EF1α启动子驱动的EGFP及Puro双报告基因,同时携带CMV启动子驱动的人工合成的多克隆位点的慢病毒表达载体及其构建与应用。
技术介绍
慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒(human immune-deficiency virus,HIV)为基础改造而来,具有宿主范围广,能感染分裂细胞及非分裂细胞,转染效率高,能携带多达8~10kb的外源基因等优势,是基因功能研究及基因治疗领域的重要途径之一。近年来,随着分子生物学技术的深入发展,根据慢病毒载体的物理特性将其分装到几个不同的质粒中,进一步提升了慢病毒载体用于基因治疗的安全性。这种技术改进不但使得慢病毒载体所携带的外源基因有效整合到宿主细胞的基因组并稳定表达,同时又具有较低的免疫原性,进而能有效降低慢病毒载体作为基因治疗手段的潜在风险。而且,与逆转录病毒载体相比,慢病毒载体通过随机整合的方式将外源基因插入到宿主细胞的基因组中,因此不容易造成原癌基因及致癌基因位点的插入突变。目前,基于慢病毒载体的基因转染已经在造血干细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞中取得成功,从而为有关免疫细胞相关疾病的基因治疗提供了一条有效途径。而且,慢病毒载体系统在肿瘤基因治疗领域同样显示出良好的应用前景。2006年,Levine等进行了第一项基于慢病毒载体的人体临床实验,利用表达靶向HIV的反义基因的慢病毒载体转染T细胞,并回输到患者体内,用于治疗5名经过多个疗程的抗病毒治疗仍然无效的HIV患者。结果表明,其中4名患者体内观察到靶向HIV的细胞免疫,在随后的4年随访中,未发现白血病或其他严重的与基因治疗相关的不良反应,进一步表明了慢病毒载体在临床基因治疗中基本安全。虽然通过慢病毒载体能将外源基因有效整合到靶细胞的基因组中实行稳定表达,但外源基因及慢病毒载体骨架序列的整合对靶细胞仍然存在潜在的安全风险,无法根据需要将外源基因及时删除,急需研发出既能有效筛选、鉴定转染的阳性细胞,又能根据需要有效删除外源基因及载体骨架的更加安全有效的慢病系统。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足,本专利技术的首要目的在于提供一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。该表达载体既能有效表达外源基因,又能进行荧光示踪及抗药性筛选,而且能利用Cre-LoxP系统进行外源基因有效删除。本专利技术的另一目的在于上述慢病毒表达载体的构建方法;本专利技术的再一目的在于上述慢病毒表达载体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础,通过插入多克隆位点(MCS)构建pLOX-MCS载体,同时在MCS末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因(Puro)片段,进而构建慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P;所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV(人巨细胞病毒)启动子驱动,所携带的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI等7个酶切位点,其DNA序列为:5′-ACT AGT GAT CAG AAT TCT TAA TTA ACT CGA GTC GAC GGA TCC-3′。所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方法,包含以下步骤:(1)设计合成包含SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI、MluI及KpnI等10个酶切位点DNA序列的两条引物,如下所示:MCS-F:5′-CTA GTG ATC AGA ATT CTT AAT TAA CTC GAG TCG ACG GAT CCT GCA GGA CGC GTG GTA C-3′及MCS-R:5′-CAC GCG TCC TGC AGG ATC CGT CGA CTC GAG TTA ATT AAG AAT TCT GAT CA-3′;(2)将上述两条DNA序列等量混合,进行退火反应,以形成DNA双链,进而获得预期的人工合成多克隆位点序列MCS;所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI及KpnI酶切位点的粘性末端(图1B);(3)将pLOX-TERT-iresTK质粒(美国Addgene)经SpeI和KpnI双酶切(ThermoFisher公司),电泳后,切胶回收8195bp大小片段,并与步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接、转化,挑选重组质粒,用CMV-F正向测序引物进行测序,测序正确的重组质粒命名为pLOX-MCS;所述的CMV-F正向测序引物的DNA序列如下所示:5′-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3′;所述的CMV-F正向测序引物位于MCS上游的CMV启动子内部;(4)以pB513质粒(System Biosciences公司)为模板,设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F:5′-CGG GAT CCG AAG GAT CTG CGA TCG CTC C-3′(下划线为BamHI酶切位点,5′端CG为酶切位点保护碱基),以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R:5′-GGG GTA CCT CAG GCA CCG GGC TTG CGG GT-3′(下划线为KpnI酶切位点,5′端GG为酶切位点保护碱基);用KOD-Plus-Neo高保真酶PCR扩增试剂盒(Toyobo公司)扩增EF1α-EGFP-Puro片段,大小为1986bp,切胶回收目的大小片段;(5)将步骤(4)所述切胶回收的PCR产物及步骤(3)所述pLOX-MCS载体均使用BamHI和KpnI双酶切(ThermoFisher公司),经电泳、切胶纯化后进行连接反应,转化感受态大肠杆菌DH5α(北京天根生化科技有限公司);(6)对步骤(5)所述的转化平板进行单菌落挑选,进行菌落PCR及双酶切(BamHI和KpnI)鉴定,结果均为阳性的单克隆分别用CMV-F及Sp6-R(Sp6-R:5′-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3′)进行正、反双向测序。所述CMV-F正向测序引物位于插入位点上游的CMV启动子内部,Sp本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种基于Cre‑LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P,其特征在于:该慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P是以慢病毒载体pLOX‑TERT‑riesTK为基础,通过插入多克隆位点构建pLOX‑MCS载体,同时在入多克隆位点末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段,进而构建慢病毒表达载体pLOX‑CMV‑E/P;所述载体pLOX‑CMV‑E/P所携带的多克隆位点由CMV启动子驱动,所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。

【技术特征摘要】
1.一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在
于:该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为
基础,通过插入多克隆位点构建pLOX-MCS载体,同时在入多克隆位点末端引
入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段,进而构建慢病毒表
达载体pLOX-CMV-E/P;所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV
启动子驱动,所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。
2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在于:
所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、
EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P,其特征在
于:所述的多克隆位点的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1~3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方
法,其特征在于包含以下步骤:
(1)设计合成两条引物,分别见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3;
(2)将上述两条引物等量混合,进行退火反应,以形成DNA双链,进而
获得人工合成多克隆位点序列MCS;所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI
及KpnI酶切位点的粘性末端;
(3)将经过SpeI和KpnI双酶切的pLOX-TERT-iresTK质粒DNA片段,与
步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接,构建pLOX-MCS载体;
(4)设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R,以
pB513质粒为模板,PCR扩增EF1α-EGFP-Puro片段;
(5)将步骤(4)所述的PCR扩增产物及步骤(3)所述的pLOX-MCS载体
均使用BamHI和KpnI双酶切,然后进行连接反应,将EF1α-EGFP-Puro片段插入
到pLOX-MCS载体多克隆位点中的BamHI与KpnI...

【专利技术属性】
技术研发人员:齐绪峰夏景波陈卓莹蔡冬青吴彩红王健欢毛承舟刘光辉
申请(专利权)人:暨南大学
类型:发明
国别省市:广东;44

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