一种提高丙丁梭菌ABE发酵丁醇/丙酮比和丁醇产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高丙丁梭菌ABE发酵丁醇/丙酮比和丁醇产量的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术以玉米粉为发酵原料，通过在丙丁梭菌产溶剂期适量添加活性酿酒酵母和丁酸溶液，形成丙丁梭菌-酿酒酵母混合培养体系。在严格厌氧、酿酒酵母生长环境苛刻的条件下，酿酒酵母可自身分泌出各种氨基酸。其中，有利于丁醇合成的芳香族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸大量积累。在此基础上，添加少量的丁酸还可以弱化丁酸闭环回路的代谢强度。两者共同作用，可以在总溶剂生产强度不变或略有提高的前提下，使ABE发酵的丁醇/丙酮比和最终丁醇浓度大幅提高。本发明专利技术的丁醇/丙酮比和丁醇浓度两项指标是利用野生丙丁梭菌间歇式发酵生产丁醇相关研究报道的最高水平，对ABE发酵具有重要指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高ABE发酵丁醇/丙酮比和丁醇产量的方法，尤其是一种丙丁梭菌和酿酒酵母混合培养提高丁醇/丙酮比和丁醇产量的ABE发酵方法，属于生物

技术介绍
丁醇是一种重要的平台化合物，在化工、塑料、医药、有机合成和印染等行业具有广泛用途。同时，生物丁醇也是一种极具潜力、清洁可再生的新型液态燃料，可作为化石燃料的替代品。发展生物燃料已成为世界各国应对能源危机、减少温室气体排放、改善气候环境的重要措施。丁醇发酵一般分为两个阶段：第一阶段为产酸阶段，丁酸和乙酸大量生成，pH迅速下降；第二阶段为产溶剂阶段，生成的丁酸和乙酸被逐步消耗，丁醇和丙酮开始大量积累，pH逐渐回升。两个阶段之间的过渡称为相转型。利用产溶剂梭菌(Clostridia)和生物质原料发酵生产丁醇受到人们越来越多的关注。在使用产溶剂梭菌发酵生产溶剂的过程中，有三个最为关键的发酵指标，即丁醇产量、丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率。由于ABE(Acetone-butanol-ethanol)发酵存在严重的丁醇产物抑制，使用传统丙丁梭菌的间歇式ABE发酵，最终丁醇浓度普遍停留在12–13g/L左右。ABE发酵原位分离耦合技术是该领域的研究热点之一，然而，由于分离耦合技术的成本高、不易操作等缺点，目前工业ABE发酵生产模式仍以传统间歇式为主。为了提高丁醇产量，研究者们通过菌株诱变、分子改造途径展开了一系列工作。上世纪90年代，国外研究者利用亚硝基胍诱变拜氏梭菌，得到<br>丁醇高产菌株C.beijerinckii BA101，丁醇和总溶剂产量由原始菌株的9g/L和13g/L提高到19g/L和29g/L。通过强化丙酮合成途径上的关键酶—辅酶A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶的表达量，丙酮和丁醇产量分别由原始菌株的4.5和9.5g/L提高到8.7和13g/L，总溶剂产量提高57％。ABE发酵中，丁醇占总溶剂比例一般在60％，而另一主要溶剂产物丙酮占30％(即丁醇/丙酮比为2:1)。作为发酵产品，无论从市场价格、还是工业应用前景，丁醇都更胜丙酮一筹。因此，在总溶剂生产强度不变或略有提高的前提下，尽可能地提高丁醇/丙酮比和丁醇产量无疑是提升ABE发酵经济性的有效手段之一。强化胞内还原力NADH的合成强度是提高丁醇/丙酮比的一个潜在、有效方法。在电子往复穿梭传递系统中，由于NADH的合成需要与H2争夺电子和质子，抑制H2生成可以提高NADH合成强度。通过向发酵液中通入少量CO，可以抑制H2合成关键酶—氢化酶的活性、强化NADH合成，丁醇产量可以由4.6g/L提高到7.8g/L，丁醇丙酮比从2.8:1提高到3.6:1(Kim B H,Bellows P,Datta R,et al.Control of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum fermentations:utilization of carbon monoxide to inhibit hydrogen production and to enhance butanol yields.Appl Environ Microbiol,1984,48(4):764-770)。此外，除了直接抑制H2生成，研究者还试图在发酵过程中营造还原性环境，以增强胞内NADH的合成。研究者使用甘油和葡萄糖的混合原料、以及辅助添加1mmol/L的电子载体中性红，发现这一措施能提高胞内NADH的合成强度，使得NADH依赖型关键酶的活性提高；而有机酸合成途径上的部分酶活性则大幅降低，最终丁醇产量提高而丙酮产量降低(Girbal L,Vasconcelos I,Saintamans S,et al.How neutral red modified carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH.FEMS Microbiol Rev,1995,16(2-3):151-162)。然而，以上提高丁醇/丙酮比或丁醇产量的方法均存在明显的缺陷：或是增加了后续分离纯化(去除色素物质等)的难度，或是以牺牲总溶剂产量为代价。申请人前期研究发现通过适时添加酵母浸粉可提高木薯丁醇传统发酵的丁醇/丙酮比，此方法可以降低木薯原料丁醇发酵产溶剂期内催化有机酸再吸收和丁酸合成的关键酶编码基因ctfAB和buk的转录水平，导致流向丁酸合成/吸收再利用闭环回路的碳流减少，削弱了丙酮合成能力，增强了与丁酸合成竞争碳源的丁醇合成途径的代谢强度。其工艺成功应用于木薯传统发酵、油醇萃取发酵和生物柴油萃取发酵。然而，由于玉米原料丁醇发酵时有机酸合成和再吸收的能力强、有机酸生成/再吸收利用闭环回路的代谢强度高、生成积累的有机酸能够被迅速吸收利用并返回到代谢主途径，强化了丙酮合成路径，最终造成丙酮大量生成。因此，添加酵母浸粉无法提高玉米原料丁醇发酵的丁醇/丙酮比和丁醇产量。目前，混菌发酵技术广泛应用于食品工业、生物能源开发、生物降解和环境保护等领域，并显示出巨大的优势。在ABE丁醇发酵生产方面，研究报道主要是将产丁醇菌与产丁酸菌、产丁醇菌与枯草芽孢杆菌以及不同的丁醇生产菌混合培养以提高丁醇发酵性能。然而，现有混菌培养模式虽然在一定程度上提高了ABE发酵性能，但是丁醇产量并未达到丙丁梭菌的抑制浓度(约13g/L)，丁醇/丙酮比也未有明显提高。酿酒酵母是兼性厌氧菌，在丙丁梭菌严格厌氧发酵的恶劣环境下依旧可以生存，并有可能诱发产生一些有利于丁醇合成的物质。本专利技术利用酿酒酵母和ABE生产菌丙丁梭菌混合培养成功解决了玉米原料传统丁醇发酵中丁醇/丙酮比低、丁醇产量低的问题，与此同时，总溶剂生产效率也有提高。整个发酵操作简单、实用，经济效益明显。
技术实现思路
本专利技术的目标是提供一种丙丁梭菌和酿酒酵母混合培养提高丁醇/丙酮比和丁醇产量的ABE发酵方法。为实现上述目标，本专利技术采用的技术方案为：在玉米原料、传统丁醇发酵产溶剂期开始后，添加一定量的酿酒酵母，或者同时添加酵母和丁酸溶液，形成丙丁梭菌和酿酒酵母的混合发酵体系，酿酒酵母在严格厌氧环境中仍然可以生存，利用上述混合发酵体系形成更加适合丁醇合成的环境并弱化丁酸闭环回路的代谢强度，提高了丁醇/丙酮比和丁醇产量。所述酿酒酵母可选择市售的安琪超级酿酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司。所述丙丁梭菌可选择丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高丙丁梭菌ABE发酵丁醇/丙酮比和丁醇产量的方法，是当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期后，接入酿酒酵母培养液，或者在接入酿酒酵母的同时添加少量丁酸；维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。

【技术特征摘要】
1.一种提高丙丁梭菌ABE发酵丁醇/丙酮比和丁醇产量的方法，是当丙丁梭菌ABE发酵进
入到溶剂生产期后，接入酿酒酵母培养液，或者在接入酿酒酵母的同时添加少量丁酸；维持
ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进入溶剂生产期后，仅接种酿酒酵母时，先将
丙丁梭菌发酵液的pH上调至4.8-5.2，接种8-10％的酵母培养液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将丙丁梭菌发酵液的pH上调至5.0，接种10％
的酿酒酵母培养液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进入溶剂生产期后，共混添加酿酒酵母培养液
和pH为5.8-6.2的丁酸时，酿酒酵母培养液接种量为8-10％，丁酸的添加量为3.5-4.5g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进入溶剂生产期后，共混添加丁酸和酿酒酵母
培养液时，接种10％的酿酒酵母培养液，丁酸的添加量为4.0g/L，并将丁酸的pH用3mol/L
的氢氧化钠溶液调为6.0。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：史仲平，罗洪镇，李志刚，何珍妮，陈锐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32