本发明专利技术公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原(Flagellin)免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用，其特征在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。本发明专利技术的蛋白质芯片可以准确的探测出莱姆病患者血清中的抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体，操作简单、检测结果稳定。
【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种蛋白质芯片，具体涉及伯氏疏螺旋体感染的莱姆病病人血清中相关的抗鞭毛抗原抗体的检测蛋白质芯片及其制备与使用。 二、技术背景莱姆病(Lyme Diseas，LD)是一种由蜱虫传播的疏螺旋体感染人体，以多个器官损伤为特征的感染性疾病。在世界范围内，莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区，在中国，莱姆病的发病主要分布在大兴安岭地区以及大别山地区。莱姆病的主要病原体为疏螺旋体，分为三个亚型：伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，阿弗西尼疏螺旋体(Borrelia afzelii)和伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)。儿童发病率高于成人。环形游走性红斑(Erythema migrans，EM)是伯氏疏螺旋体感染的临床特征性表现，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。 目前，在实验室诊断方面，许多技术可应用于确诊伯氏疏螺旋体的感染，其中包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。 目前公认的是，伯氏疏螺旋体菌体在感染后，人体免疫反应对其产生抗体主要针对于其鞭毛抗原(Flagellin)和外表面蛋白C抗原(Outer space protein C，OspC)。其中，鞭毛抗原是伯氏疏螺旋体主要的免疫性抗原。在感染伯氏疏螺旋体的早期和晚期都能够发现抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原抗体在血清中的表达。与其他菌体抗原相比，抗鞭毛抗原抗体检测目前是用于诊断伯氏疏螺旋体感染莱姆病较为理想的血清学指标。其中，血清中的IgG抗体分子量小，在疾病的发生中产生晚，维持时间长，消失慢，浓度高，可作为疾病既往感染的指标；而血清中的IgM抗体分子量大，在感染的初期就可检测到，维持时间短，消失快，是作为疾病急性期感染的指标。 生物芯片是近几年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一体的高新技术，利用微电子芯片技术的集成化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊标志 物的生物样品有序地固化在玻璃片、硅片、金属片和高分子材料等基质表面，并利用微量反应提及，一次杂交就可以对许多血清中的生物标志物、突变或多态性进行特异、快速、精确检测。尤其是随着生物芯片技术以其高通量、高敏感性和高特异性的优势，其在生物学领域应用以及实验室技术方面应用已广泛被接受，在针对疾病大规模的人群筛查方面更是优势明显，已经在基因筛查、基因诊断、蛋白质相互作用以及细胞功能研究等领域获得成功应用。蛋白质芯片不仅可以研究蛋白间相互作用，并且由于其可以对痕迹材料进行检测，大大增加了检测物的敏感性，所以在疾病标志物的实验室诊断方面，其应用越来越广。 为了弥补临床上诊断伯氏疏螺旋体感染引起的莱姆病中产生的检测时限长、易误诊漏诊等情况的发生，因而，研发一种新型蛋白质芯片，对导致莱姆病的伯氏疏螺旋体鞭毛抗原产生的血清IgG抗体和IgM抗体进行检测，将大大提高临床诊断率以及对疾病高发区的人群进行有效筛查，这无疑具有潜在的临床价值和社会效益。 三、
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片及其制作方法和使用方法。 本专利技术的另一个目的在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片试剂盒。 本专利技术解决技术问题采用如下技术方案： 本专利技术公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特点在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。 本专利技术同时公来了用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备方法，其特点在于按如下步骤进行： 步骤1：对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体 以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以100mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺构成的混合液为修饰液2；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再浸于所述修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N,N-二甲基甲酰胺和PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0.01M； 步骤2：固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针 将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12.5μg/mL的蛋白溶液； 将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4℃～37℃孵育0.5～12h，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片； 其中，步骤1对金箔芯片进行清洗的方法优选为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。 本专利技术上述用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的使用方法，其特点在于： 将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgG荧光二抗溶液； 将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4.9μg/mL的IgM荧光二抗溶液； 将待诊断患者血清点样于所述蛋白质芯片的任意两个伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针上，常温条件下孵育抗体1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干； 将所述IgG荧光二抗溶液和所述IgM荧光二抗溶液分别点样于一个孵育有抗体的探针之上，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干； 若探针处呈现荧光色，则待诊断患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原IgM抗体，若探针处无荧光色，则待诊断患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原IgM抗体； 在使用时，还应同时将健康人血清同时点样于同一蛋白质芯片的其他伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针上，作为阴性对照。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特征在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16‑氨基‑1‑十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在所述16‑氨基‑1‑十六烷硫醇上结合有4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯和4‑(二甲氨基)吡啶。
【技术特征摘要】
1.一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特征在于：在固相载体表
面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰
的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸
琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。
2.一种权利要求1所述的用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备方
法，其特征在于按如下步骤进行：
步骤1：对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以100mg 4-(N-马来酰
亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10mL N,N-二甲基甲
酰胺构成的混合液为修饰液2；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下
室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再浸于所述修饰液2之
中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N,N-二甲基甲酰胺和PBST溶液清洗、
氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，
在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0.01M；
步骤2：固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针
将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12.5μg/mL的蛋
白溶液；
将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4℃～37℃孵育0.5～12h，取出后用PBST溶液清洗、
氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片；
所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述
PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0.01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0.1％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：
将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清
洗...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫东，叶雷，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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