快速检测微小核糖核酸的检测卡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，包括样品垫，纳米材料垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，硝酸纤维素膜即为检测卡基体，检测卡基体上分布有进样区、空白对照区及样本检测区，进样区与样本检测区连通，空白对照区及样本检测区均修饰有具有与待测miRNA互补的miRNA序列的探针，探针一端与检测卡基体连接，探针另一端携带有荧光基团。本发明专利技术还公开检测卡的制备方法。本发明专利技术还公开一种快速检测微小核糖核酸的试剂盒。本发明专利技术还公开检测卡和检测试剂盒的应用。本发明专利技术对肺癌相关miRNA具有较高的检测灵敏度，无需PCR可同时检测多种miRNA，提高了临床诊断特异性，满足筛选、诊断肺癌及判断治疗效果与随访应用需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微小核糖核酸(miRNA)的检测方法，特别涉及快速检测微小核糖核酸的检测卡及其制备方法和应用，属于检测

技术介绍
肺癌在我国慢性肿瘤中发病和死亡率均处第一位，影像学和形态发现时已进入晚期，目前无特异性标志物可用，如何开发出一种快速诊断且适用于临床发病早期的肺癌检测技术，一直都是本领域的技术难点。近年来，随着人们对人类基因组研究的不断深入，逐渐揭示了MicroRNA(miRNA)在肺癌发生、转移以及细胞凋亡等之间存在较强的关联。miRNA是一种高保守，长度大概21-23个核苷酸，非蛋白编码RNA，起着调节基因表达的作用。目前已经报告一批miRNA可能成为诊断肺癌的标志物，这些miRNA在肺癌的不同阶段高度和特异表达，进入循环血中后稳定持续时间长，是极其早期诊断的潜在标志物。然而，当前检测miRNA必须依靠PCR扩增放大，耗时长，重复性差，不能满足临床需求。因此，开发出一种快速、无需PCR扩增的miRNA检测技术具有重要的应用价值。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，可以实现肺癌相关标记物的高灵敏检测，且操作简单，成本低廉，无需PCR扩增技术。本专利技术的第二个目的是提供了上述检测卡的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供了一种快速检测微小核糖核酸的试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供了上述检测卡和试剂盒的应用。技术方案：为实现上述专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案是：一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，包括依次相连的样品垫，纳米材料垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜即为检测卡基体，所述检测卡基体上分布有进样区、空白对照区及样本检测区，所述进样区与样本检测区连通，所述空白对照区及样本检测区均修饰有具有与待测miRNA互补的miRNA序列的探针，所述探针一端与检测卡基体连接，所述探针另一端携带有荧光基团。上述的纳米材料垫为金纳米颗粒结合区域。进一步的，所述待测miRNA的序列包括miR-21、miR-24、miR-25、miR-30a、miR-100、miR-126、miR-143、miR-145、miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、miR-200b、miR-320、miR-331中的任一种或两种以上的组合。进一步地，所述检测卡有1组～10组空白对照区和样本检测区，以实现对单一种类miRNA或多种minRNA的检测，提升检测卡的检测通量。进一步地，所述荧光基团为Cy3或Cy5。快速检测微小核糖核酸的检测卡的制备方法，包括以下步骤：1)合成含有miRNA的探针，首先在miRNA一端修饰由5至20个碳原子组成的碳链，在另一端修饰荧光基团，然后合成得到探针；2)在硝酸纤维素膜表面即检测卡基体上限定一组空白对照区以及样本检测区，将含有浓度为10ng/L～1mg/L的步骤1)所述探针的溶液喷涂至空白对照区及样本检测区，并于温度为37℃的条件下保持1h以上；其中喷涂溶液体积可以依据实际需求而定，例如，可以为100μL至2mL。3)将步骤2)修饰完成的硝酸纤维素膜切割成合适尺寸，然后与样品垫、纳米材料垫和吸收垫组装成检测卡。一种快速检测微小核糖核酸的试剂盒，包含上述的检测卡和金纳米颗粒标记的miRNA，所述金纳米颗粒标记的miRNA具有与待测miRNA相同的序列。进一步地，所述金纳米颗粒标记的miRNA中，miRNA共价连接于金纳米颗粒表面，所述金纳米颗粒的粒径为5nm～50nm，其在与前述荧光基团接近时，将产生较高的荧光淬灭效率。为促进前述miRNA与金纳米颗粒的连接，可对所述金纳米颗粒的进行表面修饰，例如，在金纳米颗粒表面包裹柠檬酸三钠等物质，以及，在miRNA末端修饰巯基等，利用巯基与金的共价结合，将前述miRNA较为稳定的连接于金纳米颗粒表面。上述的检测卡、试剂盒在检测微小核糖核酸中的应用。上述的应用，将包含有待测miRNA的样本与金纳米颗粒标记miRNA的混合溶液共同滴加至检测卡的进样区，并使所述混合溶液定向流动至样本检测区，与固定在样本检测区的探针结合；检测样本检测区及空白对照区的荧光强度，并将样本检测区的荧光强度与空白对照区的荧光强度进行比对，从而获知样本中的待测miRNA浓度。将样本加入检测卡后，保持15min～60min再进行荧光强度测量，检测温度为20℃～50℃。在测得空白对照区以及样本检测区的荧光强度后，将样本检测区的荧光强度除以空白对照区的荧光强度，结合标定曲线而判断出样本中待测miRNA的浓度。其中，前述标定曲线的建立方式是业界悉知的，即，可依据前述检测方法，加待测miRNA的一系列不同浓度的标准样品分别与金纳米颗粒标记miRNA分别混合后加入所述检测卡，并记录各标准样品相应的荧光强度，继而建立能反应出标准样品浓度与检测荧光强度之关系的标定曲线。利用本专利技术的检测方法，可以在短至十几分钟的时间内完成测试，无需复杂设备，且检测浓度可低至fmol/L水平。进一步地，本专利技术中，前述的样本可直接来源于血清、血液等体液。检测原理为竞争法：将包含有待测miRNA的样本与金纳米颗粒标记miRNA的混合溶液共同滴加至检测卡的进样区，并使所述混合溶液定向流动至样本检测区，与固定在样本检测区的探针miRNA结合，探针miRNA表面携带有荧光基团。上述两种miRNA会竞争性地与探针miRNA相结合，当金纳米颗粒标记的miRNA结合后，会淬灭掉原miRNA探针的荧光，淬灭程度与待测miRNA的浓度相关。检测样本检测区及空白对照区的荧光强度，空白对照区系作为质控线，其荧光强度用于质控；并将样本检测区的荧光强度与标准曲线进行比对，从而获知样本中的待测miRNA浓度。检测卡中分布有多组空白对照区以及样本检测区，通过检测每组空白对照区以及样本检测区的荧光信号，可以判断待测样本中的目标miRNA含量。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点包括：(1)本专利技术通过使用miRNA作为肺癌检测的标志物，多组miRNA并行检测，可以涵盖足筛选、诊断肺癌及判断治疗效果与随访应用需求；(2)提供了一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，利用该检测卡，可以实现对与肺癌相关的miRNA分子的快速、高灵敏检测，无需复杂操作，效率高，成本低廉，并可根据实际需要检测特定单种或多种miRNA分子，而通过评价不同miRNA的含量水平，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，包括依次相连的样品垫，纳米材料垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，其特征在于，所述硝酸纤维素膜即为检测卡基体，所述检测卡基体上分布有进样区、空白对照区及样本检测区，所述进样区与样本检测区连通，所述空白对照区及样本检测区均修饰有具有与待测miRNA互补的miRNA序列的探针，所述探针一端与检测卡基体连接，所述探针另一端携带有荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测微小核糖核酸的检测卡，包括依次相连的样品垫，纳米材
料垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，其特征在于，所述硝酸纤维素膜即为检测卡基体，
所述检测卡基体上分布有进样区、空白对照区及样本检测区，所述进样区与样本
检测区连通，所述空白对照区及样本检测区均修饰有具有与待测miRNA互补的
miRNA序列的探针，所述探针一端与检测卡基体连接，所述探针另一端携带有
荧光基团。
2.根据权利要求1所述的快速检测微小核糖核酸的检测卡，其特征在于，
所述待测miRNA的序列包括miR-21、miR-24、miR-25、miR-30a、miR-100、
miR-126、miR-143、miR-145、miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、
miR-200b、miR-320、miR-331中的任一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求1所述的快速检测微小核糖核酸的检测卡，其特征在于，
所述检测卡有1组～10组空白对照区和样本检测区。
4.根据权利要求1所述的快速检测微小核糖核酸的检测卡，其特征在于，
所述荧光基团为Cy3或Cy5。
5.权利要求1～4任一项所述的快速检测微小核糖核酸的检测卡的制备方法，
其特征在于，包括以下步骤：
1)合成含有miRNA的探针，首先在miRNA一端修饰由5至20个碳原子
组成的碳链，在另一端修饰荧光基团，然后合成得到探针；
2)在硝酸纤维素膜表面即检...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔涛，张寄南，王炜，张雷，程国胜，
申请(专利权)人：南京博纳天元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32