植物无选择转化制造技术

本发明专利技术涉及植物无选择转化方法。本发明专利技术提供用于鉴定再生转化植物和分化的转化植物部分的方法，所述方法在使植物细胞再生以得到分化组织之前，无需让植物细胞经历选择条件。在具体的实施方案中，所述植物细胞是玉米植物细胞。也提供了植物的培育和处理方法，包括对表现出特定目标性状的植物的鉴定方法。

【技术实现步骤摘要】
植物无选择转化 本申请是申请日为2007年8月31日的中国专利申请200780039999. 9植物无选 择转化的分案申请。 专利技术背景 本申请要求于2006年8月31日申请的美国临时申请顺序号60/841，519的优先 权，该临时申请所公开的全部内容都通过引用结合到本文中。 1.
本专利技术涉及植物生物
。具体地讲，本专利技术涉及产生转基因植物的方法，该 方法在得到再生植物或植物部分之前无需使用选择标记基因。 2.
技术介绍
植物细胞的稳定转化和转基因植物的产生通常需要选择步骤，其中在接触一个或 多个外源核酸序列（包括含有一个或多个编码目标基因和标记基因的序列的外源核酸序 列）后，在选择剂存在下选择植物组织。经过这样的选择后，可使含有目标基因（GOI)的稳 定转化植物再生并进行鉴定。然而，一旦产生含有GOI的转化植物后，通常就不再需要本身 并非GOI的可选择或可筛选的标记基因，而且其存在可能使后续分析和产品开发工作变得 复杂化。此外，需要强启动子以驱动选择标记，已经显示出会偏倚所需基因的表达（Υ〇〇等， 2005)。 已经报道了产生无标记基因的转基因植物的各种方法，例如共转化、可转座元件、 位点特异性重组和染色体内重组（例如Darbani等，2007)。然而，这些系统大部分既耗时 又低效。Goldsbrough(2001)综述了在转基因植物的产生中避免使用或排除选择标记基因 的方法。 DeVetten等（2003;和美国专利申请公布说明书2005/0097641)描述了营养体繁 殖作物（例如马铃薯）的无标记转化方法，然而会产生嵌合植物。Palys等（PCT公布说明 书TO2004/081184)介绍了番茄、莴苣和甘蓝的无选择转化。Francis和Spiker(2005)介 绍了用基于PCR的筛选来鉴定转基因拟南芥（Arabidopsis)系，以免转基因整合中的选择 偏倚。相比之下，本专利技术提供通过在获得再生玉米植物之前不需要存在选择剂或可筛选标 记基因（例如目测标记基因）的方法而快速有效产生种系转化玉米植物的方法。
技术实现思路
-方面，本专利技术提供转基因玉米植物的鉴定方法，所述方法包括：(a)获得用含有 目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞；(b)不经过测定所述DNA区段存在的初次 筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植株或分化的玉米植物部分；和（c)从多个玉米植株 或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。在一 些实施方案中，DNA区段不包含选择标记基因或目测标记基因。在其它实施方案中，植物在 固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养基组合上生长而得以再生。在具体的实施方 案中，植物通过接触GOI之后仅在液体培养基上生长的细胞、而在鉴定转基因玉米植物或 转基因分化植物部分之前就得以再生。在某些实施方案中，将接触GOI之后仅生长在液体 培养基中的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率，与接触GOI 之后在固体培养基或土壤上生长的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细 胞转化频率进行比较，前者相对更高。 在某些实施方案中，植物细胞是未成熟的玉米胚细胞。在具体的实施方案中，未成 熟玉米胚的长度约I. 5mm至约3. 5_，或长度约I. 9mm至约2. 3_。 在某些实施方案中，所述方法在步骤（b)与（c)之间还包括（1)将多个玉米植物 或分化的植物部分放入装有生长培养基或水的培养管或生长穴盆（growthplug)中并保留 玉米植物各自的识别标记；和（2)让植物或植物部分经历至少第一测定，看DNA区段是否存 在，从而根据测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。测定还可选自DNA 印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和DNA区段所编码的酶活性测定。 在具体的实施方案中，在将再生植株植入土壤之前进行测定。在其它实施方案中，鉴定推定 缺乏目标核酸序列的转化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含汇集所述多个玉米植物 或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物组织上进行测定。 在一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使玉米植物或 玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使 玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后 不迟于3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些实施方案中，在DNA区段转化到玉 米植物细胞后不迟于2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区 段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使玉米植物或玉米植物部分再生。 在某些实施方案中，通过细菌介导的转化、电穿孔、PEG介导的转化或粒子轰击法， 将DNA区段引入玉米植物细胞中。在具体的实施方案中，细菌介导的转化是由选自土壤杆 菌（Agrobacterium)细胞、根瘤菌（Rhizobium)细胞、中华根瘤菌（Sinorhizobium)细胞和 中间根瘤菌（Mesorhizobium)细胞的细菌细胞介导的。 该方法还可包括在植物或植物部分再生后、使从第一玉米植物细胞获取的玉米植 物或植物部分经历培养条件的步骤，所述条件选择或允许筛选目标核酸序列的存在与否。 在某些实施方案中，生长培养基是固体培养基。在又一些实施方案中，生长培养基是液体。 在再一些实施方案中，生长培养基是土壤。在其它实施方案中，再生植物或分化的植物部分 就DNA区段的存在而言是一致的。 附图简沭 下列附图构成本说明书的组成部分，用于进一步证明本专利技术的某些方面。参考这 些附图中的一幅或多幅并结合本文所给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本 专利技术。 图1.无选择（nosel）转化方案和2T转化方案的示意性比较。（有关2T策 略的细节请参见Huang等，2004)。 图2.用代表性再生品系的⑶S进行的组织化学分析。 图3.通过用草甘膦溶液喷洒各植株后无选择方法的草甘膦耐受性事件的恢 复。 图4.来自如实施例4所述的所选Rtl植物的代表性DNA印迹分析数据。 图5.用Rtl花粉和与亲本系回交验证GUS基因的继代种系传递和分离。 图6.所选独立转化事件后代的DNA印迹分析数据，证明转化序列（CP4基因）的 稳定传递。 图7.安排生长穴盆以允许在转基因序列存在的测定后容易鉴定各个植株。 图8.利用半固体培养基-比较有选择方法和无选择方法的再生方案的示意图。 图9.用获取再生植株之前的无选择液体培养的再生方案-增殖培养基的比较。 【具体实施方式】 许多现代遗传转化植物的产品开发都包括将多个转基因性状集中在一起，从而给 农民们提供多个增值性状。该方法的一个主要瓶颈就是存在着选择标记基因，在转化期间 这些基因与目标基因（GOI) -起携带，因为该过程通常依赖于使用选择标记基因以确保植 物细胞的转化。尽管在转化后去除选择标记基因有多种方法可行，但这些方法通常都耗时 且效率也不高。 本专利技术通过开发无需使用选择标记基因的有效转化方法，以及用于推进无选择产 生的转基因事件的有效的植物处理和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a) 获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞；(b) 不经过针对所述DNA区段存在的初次筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植物或分化的玉米植物部分；(c) 从所述多个玉米植物或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。

【技术特征摘要】
2006.08.31 US 60/841,5191. 一种鉴定转基因玉米植物的方法，所述方法包括： (a) 获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞； (b) 不经过针对所述DNA区段存在的初次筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植物或 分化的玉米植物部分； (c) 从所述多个玉米植物或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物 或转基因分化植物部分。2. 权利要求1的方法，其中所述DNA区段不包含选择标记或目测标记基因。3. 权利要求1的方法，其中所述植物在固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养 基组合上生长而得以再生。4. 权利要求3的方法，其中所述植物通过仅在液体培养基上生长而得以再生，然后鉴 定所述转基因玉米植物或转基因分化植物部分。5. 权利要求4的方法，其中将细胞与GOI接触之后、鉴定转基因植物或转基因植物部 分之前仅生长在液体培养基中的细胞的转化频率，与将细胞与GOI接触之后、鉴定转基因 植物或转基因植物部分之前在固体培养基、半固体培养基、土壤或者固体培养基、半固体培 养基、液体培养基和/或土壤的组合中生长的细胞的转化频率进行比较，前者相对更高。6. 权利要求1的方法，其中所述植物细胞是未成熟玉米胚细胞。7. 权利要求6的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为约1. 5 mm至约3. 5 mm。8. 权利要求7的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为约1. 9 mm至约2. 3 mm。9. 权利要求1的方法，所述方法在步骤（b)与（c)之间还包括： (1) 将所述多个玉米植物或分化的植物部分放入包含生长培养基或水的培养管或生 长穴盆中，同时保留玉米植物各自的识别标记；和 (2) 让所述植物或植物部分经历至少第一测定，看所述DNA区段是否存在，从而根据 所述测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。10. 权利要求9的方法，其中所述测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：JR劳特，
申请(专利权)人：孟山都技术有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US