一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，本发明专利技术提供了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法和应用。本发明专利技术所述的基因载体是由硬脂酰修饰的多肽经二硫键桥连而成的；本发明专利技术还涉及上述基因载体的制备方法，以及上述基因载体在基因治疗中的应用。本发明专利技术的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体具有转染细胞效率高且细胞毒性低的特点，为基因治疗中的基因递送提供了一种有效的手段。

【技术实现步骤摘要】
一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与 应用
： 本专利技术涉及医药
，具体涉及一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及 其制备方法与应用。
技术介绍
： 基因治疗是将基因（主要为DNA或RNA)传递到病人特定细胞中，从而促进或抑制 目标蛋白的表达，达到治疗人类疾病的目的。在基因治疗实际应用过程中，由于基因片段容 易被核酸酶降解，且带负电荷，分子量较大，本身很难通过带负电荷的细胞膜，这就需要利 用基因载体来保护并传递基因片段进入到细胞内。基因载体既要保证高的转染效率，又要 有较低的细胞毒性。因此，发展低毒高效的基因传递载体是基因治疗成功应用的重要前提。 基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒类基因载体是将病毒中的致病基 因以治疗基因替代，由于控制病毒进入细胞、胞内运输以及编码进入细胞核部分的基因还 在病毒载体上，所以病毒载体的优点是靶基因表达效率高，但同时也有免疫原性、可能激活 原癌基因引发肿瘤及难以大量制备等缺点，从而限制了病毒载体的临床应用。非病毒基因 载体的优势在于免疫原性弱，制备方便，对基因材料的要求限制少。非病毒基因载体分为聚 合物和脂质体两大类，前者有聚乙烯亚胺（PEI)、壳聚糖（CS)、聚氨基酸（PAA)、树枝状大分 子（PAMM)、多肽等，后者有阳离子脂质体、DNA脂质涂层复合物、类脂质体等。 多肽类载体主要是指细胞穿透肽（CPP)，由于容易制备，毒性低，同时还具有穿透 细胞膜的特性，近年来受到了很大的关注。细胞穿透肽能够与基因片段形成载体/基因 复合物，从而有效地引导基因片段进入细胞，研究发现细胞穿透肽中的带正电的氨基酸如 精氨酸在引导基因片段进入细胞中发挥了主要作用（van Asbeck AH, Beyerle A, McNeill H, Bovee-Geurts PH, Lindberg S,Verdurmen WPj et al.Molecular parameters of siRNA-cell penetrating peptide nanocomplexes for efficient cellular delivery. ACS nano. 2013 ;7:3797-807.)。 载体/基因复合物通过内吞作用进入细胞后首先富集在内吞体中，之后内吞体与 溶酶体融合，基因片段进入溶酶体，在溶酶体中降解。因此基因片段必须从内吞体和溶酶体 中释放，进入到细胞质中才能够发挥作用。研究发现组氨酸具有质子海绵作用，可以在内 吞体和溶酶体中溶液的PH降低时与氢离子结合，从而阻止内吞体中溶液的PH值下降，引起 Cl-内流，导致内吞体和溶酶体渗透性肿胀，最后内吞体和溶酶体破裂从而将基因片段释放 到细胞质中。 硬脂酰基是一种亲脂性基团，与细胞膜脂质双分子层有很高的亲和力，利用硬脂 酰修饰基因载体可以增加载体与细胞膜的亲和力，从而提高载体引导基因片段进入细胞的 能力。 基于上述理论，本专利技术提供了一种富含精氨酸和组氨酸并修饰有硬脂酰基团的可 降解多肽基因载体，克服了当前多肽类载体还存在引导基因片段进入细胞的能力不强、基 因转染效率不高、不可降解的缺陷。 目前尚无有关硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的文献报道。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于提供一种可生物降解的，且引导基因片段进入细胞的能力强、 基因转染效率高的多肽类基因载体；本专利技术的另一目的是提供该多肽类基因载体的制备方 法；本专利技术的第三目的是提供该多肽类基因载体在制备基因治疗药物中的应用。 本专利技术所要解决的主要技术问题是：如何提高多肽类基因载体引导基因片段进入 细胞的能力，以及如何提高多肽类基因载体所载基因的转染效率，同时保证材料具有可生 物降解特性。 本专利技术基于：一是细胞膜由磷脂双分子层构成，基因载体经亲脂性基团硬脂酰基 修饰后可以增加与细胞膜亲和力，从而增加基因载体引导基因片段进入细胞的能力。二是 同一类基因载体的转染效率和细胞毒性往往与分子量有关，一般来说多肽载体分子量较 低，基因转染效率比较低，将多肽载体聚合起来，可以增加分子量载体的基因转染效率，但 同时也可能会增加载体的细胞毒性。由于细胞内富含谷胱甘肽,细胞内的内质网中也含有 二硫键异构酶，这两种物质都能够迅速的将二硫键打开，多肽载体经过二硫键桥连聚合后， 可以在不增加细胞毒性的情况下，增加基因转染效率。 本专利技术设计了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，由精氨酸、组氨酸、硬脂 酰基和半胱氨酸组成的多肽，精氨酸带正电可以与带负电的基因片段结合并具有穿膜作 用，组氨酸可以促进基因片段进入细胞后迅速的释放到细胞质中，硬脂酰基可以增加载体 与细胞膜的亲和力，半胱氨酸的巯基氧化形成二硫键，从而使多肽聚合起来，形成高分子的 聚合物。 本专利技术的第一个方面，是提供了一种硬脂酰修饰的多肽，所述的多肽的氨基酸序 列如下所示： HHHCRRRRRC(SEQ ID N0:1);氨基酸之间以肽键相连，多肽可简写SH3CR5C,缩写为 HR ； 所述的硬脂酰修饰，是指硬脂酰基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。 本专利技术所述的硬脂酰基修饰的多肽可以简写为：Stearyl-H3CR5C，可简写为SHR， 其中stearyl-为硬脂酰基，H为组氨酸，C为半胱氨酸，R为精氨酸，Stearyl-H 3CR5C缩写为 SHR。 进一步地，本专利技术提供了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，所述的基因 载体为上述的硬脂酰修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式（I )所示，其 中的n为彡3的整数： 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硬脂酰修饰的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸之间以肽键相连；所述的硬脂酰修饰，是指硬脂酰基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。

【技术特征摘要】
1. 一种硬脂酰修饰的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 示，氨基酸之间以肽键相连； 所述的硬脂酰修饰，是指硬脂酰基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。2. -种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，其特征在于，所述的基因载体为如权利 要求1所述的硬脂酰修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式（I )所示，其 中的n为彡3的整数：所述的硬脂酰修饰的多肽的通过半胱氨酸经二硫键连接形成聚合物。3. 根据权利要求2所述的一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，其特征在于，所 述的聚合物的分子量为5000-50000Da。4. 一种如权利要求2所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征 在于，所述的制备方法包括如下步骤： (A) 合成如权利要求1所述的一种硬脂酰修饰的多肽； (B) 硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备：将步骤（A)合成的硬脂酰修饰的多 肽溶于水，加入半胱氨酸盐酸盐，使硬脂酰修饰的多肽与半胱氨酸的摩尔比为2. 5-15:1，调 节溶液的pH为7-8 ;在搅拌下加入过氧化氢H2O2，至过氧化氢的终浓度为0. 02% -0. 5 %，搅 拌反应6-24小时。5. 根据权利要求4所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征在 于，步骤（B)具体为： 取步骤（A)合成的硬脂酰基修饰的多肽与半胱氨酸盐酸盐溶解在水中，使得硬脂酰基 修饰的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：高申，台宗光，朱全刚，王晓宇，田泾，姚翀，刘旭，胡楚玲，顾芬芬，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31