一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建制造技术

本发明专利技术涉及一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建方法，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。应用时将含有类白质样结构干细胞源性少突胶质细胞和类灰质样结构干细胞源性神经元构建的类脊髓样组织移植到横断性脊髓损伤处，按照类白质样结构对应宿主白质、类灰质样结构对应宿主灰质的配对方式整合到宿主神经网络中，更好地促进受损伤脊髓再生和功能修复。

【技术实现步骤摘要】
一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建
本专利技术涉及一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。
技术介绍
在脊髓损伤修复的研究领域，联合利用干细胞、神经营养因子和生物材料已经展示了令人鼓舞的成果。然而，目前的联合治疗策略或单一地强调替代神经元的作用，或单一的强调移植的成髓鞘细胞的修复作用。这些对于脊髓损伤的功能修复而言都是不够的。我们的前期研究基于脊髓损伤后大量丢失的神经元和成髓鞘细胞。应用过表达神经营养素-3 (neurotrophin-3, NT-3)的施万细胞(Schwann cells, SCs)和过表达 NT-3 受体TrkC的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)在三维明胶海绵支架中构建了有大量的可替代神经元，具有良好的突触形成潜能的，和有大量的成髓鞘细胞，具有良好的成髓鞘潜能的人工神经网络。该干细胞源性神经网络移植到大鼠脊髓全横断损伤处，不但能够提供丰富的神经营养因子促进宿主神经再生，移植的干细胞源性神经元还能与宿主神经网络良好地整合。成髓鞘细胞不仅能在体外包绕神经突起形成髓鞘，在体内也能形成大量髓鞘包绕移植神经元和宿主神经元的轴突，通过良好的成髓鞘潜能更进一步修复脊髓损伤[Lai BQ, et al.The integrat1n of NSC-derived and host neural networks afterrat spinal cord transect1n.B1materials, 2013, 34:2888 ;Lai BQ, et al.Graft ofatissue engineered neural scaffold serves as a promising strategy to restoremyelinat1n after rat spinal cord transect1n.Stem Cells Dev,2014,23:910]。 脊髓损伤后，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)能够作为少突胶质细胞的保护因子，促进少突胶质细胞的存活和形成髓鞘。有研究表明，CNTF可以促进少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)的存活、分化、成熟，并在再生的轴突上形成髓鞘结构[Mayer M, et al.Ciliary neurotrophic factor andleukemia inhibitory factor promote the generat1n, maturat1n and survival ofoligodendrocytes in vitr0.Development, 1994,120:143]。 然而，目前我们仍面临着脊髓损伤修复还没有解决好的关键科学问题:即前期构建的干细胞源性神经网络中，神经元和髓鞘形成细胞的分布是随意和无序的，这有可能导致再生的神经纤维不能快速、准确地与移植的神经网络进行整合，或髓鞘形成细胞不能更有效地包绕需要髓鞘化的神经元轴突。为此，我们设想:模拟正常脊髓组织结构一灰质在内、白质在外，在体外构建一种类脊髓样组织。拟将这种类脊髓样组织移植入脊髓全横断损伤处，按照白质对应白质、灰质对应灰质的配对方式整合到宿主神经网络中，更好地修复脊髓结构和功能。
技术实现思路
目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。本专利技术的目的是想克服现有临床上治疗脊髓损伤所用的方法上的不足，应用我们自行构建的类脊髓样组织治疗脊髓创伤性疾病，更好地促进受损伤脊髓再生和功能修复。 本专利技术的基本方案包括:这种类脊髓样组织是以圆柱体的多孔隙明胶为主体支架，分别由周围和中央两部分的明胶结构装配而成。周围部分的明胶结构是一种圆环状的支架(圆环外直径为3_、圆环壁厚度为0.5mm>圆环高度为2mm),用来种植睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰的少突胶质前体细胞(OPCs);中央部分的明胶结构是一种圆柱体的支架(圆柱体直径为2mm、高度为2mm)，用于种植神经营养素-3 (NT-3)基因及其受体TrkC基因修饰的的神经干细胞(NSCs)。应用时，将其移植到成年大鼠脊髓全横断损伤处。 本专利技术的优点显著:本研究选择构建一种含有睫状神经营养因子基因修饰的少突胶质前体细胞(CNTF-OPCs)、神经营养素-3基因修饰的的神经干细胞(NT-3-NSCs)和NT-3受体TrkC基因修饰的的神经干细胞(TrkC-NSCs)的类脊髓样组织，用来促进受损伤的中枢神经元轴突再生，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓损伤等进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本专利技术将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。 【具体实施方式】 下面通过具体实施例对本专利技术所用的主要仪器、可降解生物材料、可降解高分子材料、实验细胞和试剂作详尽的描述: 1.主要仪器 超净工作台(苏州净化电子设备厂)；普通离心机(久保田日本)；恒温水浴箱(北京医疗设备厂)；5% CO2培养箱(Queue美国)；倒置相差显微镜(Olympus日本)；荧光显微镜(Leica德国)；扫描电镜(Philips荷兰)；透射电镜(Philips荷兰)；激光共聚焦成像系统(Carl Zeiss德国)；低温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高压消毒锅(江阴滨江医疗设备厂)；恒冷箱切片机(Shandon英国)；超纯水仪(Molsheim法国)；酶联免疫检测仪(B1-Rad美国)；电泳仪电源(B1-Rad美国)；垂直板电泳槽(B1-Rad美国)；电转仪(B1-Rad美国)；超高速低温离心机(Beckman美国)；-80°C超低温冰箱(Revco Tech美国)；JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EPC-10膜片钳信号放大器(Heka德国)；玻璃微电极(Sutter美国)；微电极拉制仪(Sutter美国)。 2.可降解生物材料 制备类脊髓样组织的多孔隙明胶圆柱体支架材料是购自于南京金陵药业股份有限公司的产品一医用明胶海绵。 3.可降解高分子材料 包绕在多孔隙明胶圆柱体支架周围形成外壳薄壁的PLGA(50: 50)薄膜是购自于济南is?生物科技公司的产品。 4.实验细胞 由中山大学实验动物中心提供SD大鼠，自行从其大脑海马中分离、培养获取神经干细胞。 5.主要试剂 DMEM-LG(Gibico)，优级胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，D-Hank’ s 平衡液(自配)，膜蛋白酶(Sigma), EDTA(Sangon),0.01mol/l PBS(中杉金桥)，MTT(Ameresco 公司),二甲基亚讽(DMSO) (Sangon), Hoechst333本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和类灰质样结构共同构建的类脊髓样组织；其形貌特征是：类脊髓样组织表面包裹着由聚乳酸‑聚羟基乙酸共聚物(poly D，L‑lactic‑co‑glycolic acid，PLGA)薄膜构成的薄壁，类脊髓样组织中央是类灰质样结构，PLGA薄壁与类灰质样结构之间是类白质样结构。

【技术特征摘要】
1.一种用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和类灰质样结构共同构建的类脊髓样组织；其形貌特征是:类脊髓样组织表面包裹着由聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(POlyD, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜构成的薄壁,类脊髓样组织中央是类灰质样结构，PLGA薄壁与类灰质样结构之间是类白质样结构。2.根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾园山，赖碧琴，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44