本发明专利技术公开了一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。本发明专利技术公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明专利技术公开的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
【技术实现步骤摘要】
-种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种重组融合蛋白TAT-P53及其编码基因与应用，属于生物技术领 域。
技术介绍
目前全世界有3. 5亿人感染HBV，在中国约有9300万人慢性感染HBV，大约 15-40 %的感染人群可能发展为威胁生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢 性HBV感染严重危害人们身体健康。现有用于慢性乙肝患者的治疗方法包括a-干扰素 (IFN-Ci)和核苷或核苷类似物（如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦）。干扰素-a是第一 个获得临床治疗乙肝病毒感染的药物，作为重要的一线药物，聚乙二醇干扰素-a单一治 疗能有效治疗25-40 %的慢性乙型肝炎患者，其与核苷酸类似物联合使用能产生更大的持 续抗病毒疗效和使HBeAg阳性患者中病毒e抗原转阴，但干扰素-a治疗副作用明显，停药 后容易反弹，部分患者对干扰素-a反应不敏感，疗效差。核苷类似物疗程长，停药后病毒 易反弹，而且引起突变、增加耐药性。在中国，肝细胞癌多数由慢性乙肝感染引发，而且目前 临床没有有效的药物治疗。因此，迫切需要开发新的乙肝和肝癌治疗性药物以补充或替代 现有的抗病毒治疗方案。 人免疫缺陷病毒 HIV- I 的转录活化因子（Trans-activating transcriptional activator，TAT)，是最先被发现并证实的具穿膜功能的多肽分子。而其做为穿膜肽，在体内 或者离体实验中也被广泛的应用。TAT可以携带多种蛋白质，一般来讲，外源性蛋白不能进 入胞浆，但是如果将TAT与其相连，可以快速有效的被细胞摄入。 p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17pl3. 1，编码393个氨基酸组成的 53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细 胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。肝癌患者有一定 比例的P53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关。有越来越多的文 献表明，P53能抑制癌细胞生长和恶性转化，调节乙型肝炎病毒的复制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。 本专利技术提供一种蛋白，为如下（1)或（2)所示： (I)SEQ ID No. 5 所示的蛋白； (2)将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质； 所述蛋白在N端与C端还可以带有His标签。 上述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种： I) SEQ ID No. 4中自5'末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本专利技术的保护范围。 一种制备上述蛋白的方法也属于本专利技术的保护范围，是将上述任一所述的编码基 因导入原核细胞中进行表达。 上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将 所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将SEQ ID No. 4所示的DNA分 子插入pET28a⑴的BamHI和XhoI位点间得到的； 所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21 (DE3)。 上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括将细胞破碎、收集沉淀、将沉淀溶解 取上清和/或将上清进行纯化的步骤。 上述任一所述的方法中，所述破碎为超声破碎； 所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液 溶解，得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9. 8-10. 2,离心取上清，记作上清1 ;将上清1 的PH值调至7. 6-7. 8,离心取上清，即得； 所述pH值调至9. 8-10. 2时所用的溶液具体为NaOH的水溶液； 所述pH调至7. 6-7. 8时所用的溶液具体为HCl水溶液； 所述pH值调至9. 8-10. 2时所述pH具体为10. 0 ; 所述pH值调至7. 6-7. 8时所述pH具体为7. 7 ; 所述将上清进行纯化为镍离子亲和层析纯化，步骤如下： a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积； b、将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍离子柱； c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白； d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去未结合的蛋白； 所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl,尿素和咪 唑，所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液 中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪 唑溶液中的浓度为60mM，pH为7. 7 ; e、用300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，即得； 所述300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO 4, NaCl,尿素和 咪唑，所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶 液中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM 咪唑溶液中的浓度为300mM，pH为7. 7 ; 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4, NaCl，尿素和咪 唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液 中的浓度为〇. 5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿 素溶液中的浓度为20mM，pH为7. 7。 上述任一所述的方法中，所述将上清进行纯化之后还包括将纯化后的目的蛋白透 析浓缩、去除内毒素和/或除菌的步骤； 所述透析的具体条件为：在4°C条件下，用pH8. 0的IM Tris-HCl缓冲液进行透 析； 所述除菌具体为0? 22uM滤膜除菌。 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制HBV蛋白的表达、HBV mRNA转录 和/或HBV复制的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围； 所述蛋白具体为HBV表面抗原和/或HBV e抗原； 所述mRNA具体为转录合成前基因组RNA和/或总RNA ; 或， 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制和/或清除HBV的产品中的应用 也属于本专利技术的保护范围； 或， 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备预防和/或治疗HBV引起的疾病的产 品中的应用也属于本专利技术的保护范围； 所述疾病具体为肝炎、肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌。 本专利技术提供的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对 于乙肝防治具有重大价值。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
【技术特征摘要】
1. 一种蛋白，为如下⑴或⑵所示： (1) 5￡〇10此.5所示的蛋白； (2) 将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质。2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种： 1. SEQ ID No. 4中自5'末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. -种制备权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入原 核细胞中进行表达。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入 的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将 SEQ ID No. 4所示的DNA分子插入pET28a(+)的BamHI和Xhol位点间得到的； 所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21 (DE3)。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括将细胞破碎、收 集沉淀、将沉淀溶解取上清和/或将上清进行纯化的步骤。8. 根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述破碎为超声破碎； 所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液溶解， 得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9. 8-10. 2,离心取上清，记作上清1 ;将上清1的pH 值调至7. 6-7. 8,离心取上清，即得； 所述将上清进行纯化的方法为镍离子亲和层析纯化，步骤如下： a、 用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积； b、 将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟颂东，初骁宇，陈立钊，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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