细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用，本发明专利技术还公开了一种细菌菌蜕的大规模发酵方法。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定了坚实的基础；此外，本发明专利技术系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，结果表明菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效力，而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类和动物病毒性传染病的防控具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用
本专利技术涉及细菌菌蜕的规模化发酵制备方法与菌蜕作为佐剂在病毒性疫苗中的 应用。本专利技术属于基因工程与免疫学
。
技术介绍
细菌菌蜕（bacterial ghost，BG)是在革兰氏阴性菌中通过控制PhiX174噬菌体 的裂解蛋白E的表达使宿主菌发生裂解而产生的细胞空壳。E蛋白介导的溶菌通道大小受 细胞个体差异影响，孔径介于40nm到200nm之间。通道一旦形成，细菌胞浆内容物在内外 渗透压的作用下通过通道流出胞外，形成一个完成的细菌空壳。E蛋白介导的溶菌作用已成 功应用于各种大肠杆菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、霍 乱弧菌、流感嗜血杆菌、巴氏杆菌等。范围如此之大说明E蛋白介导的溶菌可能会在所有革 兰氏阴性菌中发生。 菌蜕本身可以作为一种很好的疫苗。其外壳结构没有被破坏，保留与活菌一样的 胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守 结构 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、肤聚糖、CpG、OmpA、 菌毛等，能有效地被抗原递呈细胞（APCs)吞噬、加工和递呈。这也是菌蜕与常规灭活疫苗 相比的一个突出优势。目前，菌蜕通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等 动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用胸膜肺炎放线杆菌菌蜕经气体免疫接种猪，诱 导了针对A. pleuropneumoniae引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱弧菌菌脱经皮下注射小 鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱的抗体并且足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另 夕卜，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。重组蛋白可通过特定的膜锚定结构插 入细胞膜，或填充于胞周间隙和细胞空腔中，以获得重组菌蜕多价苗和多联苗。 菌蜕生产简单，发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干的形式保存于 室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。理想的菌蜕不含胞浆、核酸等内容物，因此不 存在毒力增强的问题，使用安全，对环境无污染。 理想的佐剂是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。铝 盐佐剂是目前兽用疫苗和人用疫苗上应用最广泛的佐剂，已大量应用于细菌、病毒等病原 微生物疫苗，虽然该佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，但存在许多 不足之处：不能冻干；批次之间差异大；与许多重组或合成的多肽疫苗抗原共同免疫时未 能激发有效的免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需要。通常而言，油/水乳剂型佐 剂以注射投递途径为主，包括M F59、QS21、A S02以及Montanide等水包油或油包水型佐 齐U，这类佐剂通过肌肉或皮下注射接种来增强疫苗抗原的免疫原性。此外，机体内源性细胞 因子如IL-2、IL-12、GM-CSF等，也可作新型疫苗佐剂，主要通过注射途径进行接种，所引发 的免疫应答类型与油/水乳剂型佐剂相似。但此类佐剂大都成本较高。目前，单纯的粘膜 途径型佐剂较少，主要以大肠杆菌LT毒素及其突变体为主，诱导以粘膜免疫为主的应答反 应，分泌特异性slgA，也可产生系统性免疫应答，但强度较注射途径弱。这类佐剂较粘膜途 径投递相对安全，即便佐剂存在一定毒性，但在有效剂量时进行粘膜投递仍较为安全，而且 还具有投递简便，无创伤等显著优点。具备注射和粘膜两种免疫途径的新型疫苗佐剂受到 青睐。在不同的免疫途径下，这类佐剂既可诱导出系统免疫应答，也可产生粘膜免疫效果， 既有体液免疫也有细胞免疫。由于菌蜕拥有完好的天然的细菌外壳结构，能同时激发体液 和细胞免疫应答。其菌毛、纤毛等表面黏附结构使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道 和呼吸道的黏膜表面，容易被机体吞噬细胞，如PP结（Peyer' s Patches)的M细胞识别捕 获，因而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。 目前，国内外研究者关注的焦点是菌蜕作为一种新型疫苗用于预防细菌感染。而 系统性的评价菌蜕的佐剂功能并将其作为佐剂应用于病毒性疫苗的免疫尚未见相关报道。 另外，本专利技术克服了以往菌蜕制备规模小的瓶颈问题，利用发酵罐大量地制备了沙门氏菌 菌蜕，实现了菌蜕的规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。 其中，所述的细菌菌蜕的佐剂功能主要体现在其能特异性提高病毒疫苗的免疫效 力、提高病毒疫苗的抗体持续期以及病毒疫苗的保护率。 在本专利技术中，所述的菌蜕来自多种细菌，优选地来自沙门氏菌菌株。所述的细菌菌 蜕可经皮下、口、局部、粘膜、肺和/或鼻施用。 本专利技术的目的之二是提供一种细菌菌蜕的规模化制备方法，包括以下步骤： (1)构建含有打孔质粒PBV-E的细菌，其中所述的打孔质粒pBV-E是通过将 PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220质粒中得到的； (2)将含羧苄青霉素的LB琼脂板上的含有打孔质粒PBV-E的细菌单克隆转接到 含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养10-14小时，作为一级种子液；按 5% (v/v)接种量，将一级种子液转接到含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm培 养6小时，作为二级种子液；向发酵罐中加入LB液体培养基进行原位灭菌；按5% (v/v)接 种量，取二级种子液转接到发酵罐中同时加入羧苄青霉素进行发酵；通过程序化控制诱导 前发酵条件：37°C、200rpm、10L空气/分钟，将细菌培养至0D600 = 0· 75?L 0 ; (3)升温至42°C诱导E蛋白表达，在诱导2. 5小时的时间点，加入终浓度 150-200 μ g/ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时； (4)收集菌体，70_90°C处理，冻干。 其中，优选的，PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示。其中，优选的，各步骤中羧苄青霉素的浓度均为100 μ g/ml。 其中，优选的，所述的细菌为沙门氏菌菌株，在本专利技术的一个具体实施例中，所述 的沙门氏菌菌株为沙门氏菌Sm6。 将未加佐剂的新城疫灭活苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未加 佐剂的禽流感灭活疫苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未加佐剂的2型猪 圆环病毒疫苗半成品与所述菌蜕混合，对猪进行免疫。同时设不添加菌蜕的疫苗作为对照， 结果发现，相较于未添加菌蜕的疫苗，添加菌蜕作为佐剂的疫苗能特异性提高病毒疫苗的 免疫效力、提高病毒疫苗的抗体持续期，并最终提高病毒疫苗的保护率。 本专利技术的有益效果主要体现在： 1、本专利技术提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定了坚 实的基础； 2、系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效力， 而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类和动物病毒 性传染病的防控具有重大意义。 【附图说明】 图1为pBV_E/Sm6的裂解曲线图； 图2为Sm6菌蜕扫描电镜图； 图3为新城疫血凝抑制抗体效价检测结果； 图本文档来自技高网...

【技术保护点】
细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。

【技术特征摘要】
1. 细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能特异性提高病毒疫苗的免 疫效力。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能提高病毒疫苗的抗体持续 期。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能提高病毒疫苗的保护率。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕来自多种细菌，优选地来自 沙门氏菌菌株。6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕经皮下、口、局部、粘膜、肺和 /或鼻施用。7. -种细菌菌蜕的大规模发酵方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 构建含有打孔质粒PBV-E的细菌，其中所述的打孔质粒pBV-E是通过将PhiX174噬 菌体的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220质粒中得到的； (2) 将含羧苄青霉素的LB琼脂板上的含有打孔质粒pBV-E的细菌单克隆转接到含羧苄 青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养10-14小时，作为一级种...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思国，于申业，司微，危艳武，陈利苹，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23