本发明专利技术属于细菌基因工程领域，涉及一种根癌农杆菌中锑氧化酶基因的功能鉴定。通过基因敲除、锑生长氧化实验以及异源表达等方法，分离、克隆了一种来源于根癌农杆菌GW4中的锑氧化酶基因sboA。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。该基因编码的酶能催化毒性强的三价锑[Sb(III)]氧化至毒性弱的五价锑[Sb(V)]，具有应用于环境锑污染净化的潜能。该基因包含在原核表达载体中，含有该质粒的大肠杆菌BL21/pET28a-sboA，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：2014437。
【技术实现步骤摘要】
根癌农杆菌中锑氧化酶基因sboA的功能鉴定
本专利技术属于细菌基因工程领域，涉及一种根癌农杆菌GW4中锑氧化酶基因的功能鉴定。通过基因敲除、锑生长氧化实验以及异源表达等方法，分离、克隆了一个来源于根癌农杆菌GW4中的新型锑氧化酶基因sboA。该基因编码的酶催化毒性较强的三价锑[Sb(III)]氧化至毒性较弱的五价锑[Sb(V)]，具有应用于环境锑污染净化的潜能。
技术介绍
锑(Antimony，Sb)是一种剧毒的重金属元素，位于元素周期表中第5周期VA族，广泛分布于岩石、大气、土壤沉积物及水体中。其无机形态主要以单质锑[Sb(0)]、三价锑[Sb(III)]和五价锑[Sb(V)]的形态存在，有机形态主要为三甲基锑化合物(何孟常等，2004)。锑的毒理性质与砷相似但毒性远远大于砷，且无机锑的毒性强于有机锑，Sb(III)的毒性强于Sb(V)(SmichowskiP.Antimonyintheenvironmentasaglobalpollutant:Areviewonanalyticalmethodologiesforitsdeterminationinatmosphericaerosols.Talanta,2008,75:2)。人类长期接触锑可造成皮肤、上呼吸道、心、肝、肺等组织明显损害，最终导致机体的癌变(ShotykW,KrachlerA.Contaminationofbottledwaterswithantimonyleachingfrompolyethyleneterephthalate(PET)increasesuponstorage.EnvironSciTechnol,2007,41:1560-1563)。锑的用途广泛，包括生产陶瓷、玻璃、合金、电池、油漆、烟火材料及阻燃剂等，还可用来治疗各种寄生虫病。但随着我国经济的迅猛发展，人民生活水平提高的同时，也对环境造成了极大的污染。工业“三废”、机动车尾气的排放、污水灌溉和农药、除草剂、化肥等的使用以及矿业的发展，使大量的锑及其化合物进入到大气、水和土壤，并最终进入动植物及人体中。据国际癌症研究署(IARC)报道，充分的证据表明Sb(III)对环境中的动物有致癌作用(IARC.Someorganicsolvents，resinmonomersandrelatedcompounds,pigmentsandoccupationalexposuresinpaintmanufactureandpainting.Lyon:IARC,1989.291-305)。由于锑的毒性和生物有效性，锑及其化合物被美国环保局及欧盟列为优先污染物，日本环境厅也将其列为密切关注的污染物。在巴塞尔公约中关于危险废物的越境迁移限定中将锑列为危险废物之列(FilellaM,BelzileN,ChenYW.Antimonyintheenvironment:AreviewfocusedonnaturalwatersI.Occurrence.EarthSciRev,2002,57:125-176)。虽然锑污染严重威胁人类生命健康，但一些微生物却对环境中高浓度锑表现出极强的适应性并在锑的环境地球循环中扮演着重要的角色。因此了解微生物的重金属抗性机制，研究锑抗性相关的功能基因有助于我们从基因的水平上了解微生物对重金属的解毒机制，并发现新的重金属污染修复方法。为环境中锑污染的修复提供理论基础和技术支持，并更好的认识锑元素的环境地球循环。目前，对细菌中锑抗性分子机制的研究较少，特别是与锑氧化相关的分子机制研究相当匮乏。细菌锑氧化可以将环境中的Sb(III)转化为毒性较低的Sb(V)，降低环境毒性，对环境锑污染修复具有重要意义。迄今为止，科研工作者相继从多个种属中分离出50多株锑氧化菌(ShiZ,CaoZ,QinDetal.Correlationmodelsbetweenenvironmentalfactorsandbacterialresistancetoantimonyandcopper.PLoSOne,2013,8:e78533；LiJ,WangQ,ZhangSZ,QinD,WangGJ.Phylogeneticandgenomeanalysesofantimony-oxidizingbacteriaisolatedfromantimonyminedsoil.InternaBiodeter&Biodegra,2013,76:76-80)。但目前发现的锑氧化菌中，存在两种类型：第一类锑氧化菌既可以氧化Sb(III)又可以氧化As(III)。2007年Lehr等人发现根癌农杆菌5A为这一类锑氧化菌的代表。该菌在缺失了砷氧化酶大亚基基因aioA后，Sb(III)氧化仅受到十分微弱的影响(LehrCR,KashyapDR,McDermottTR.NewInsightsintoMicrobialOxidationofAntimonyandArsenic.ApplEnvironMicrobiol,2007,73:2386-2389)。第二类锑氧化细菌中不含砷氧化酶，但也可以氧化Sb(III)。虽然砷和锑位于同一主族，但以上结果说明细菌砷氧化和锑氧化是两个相对独立的过程，细菌内应该存在与砷氧化酶基因完全不同的锑氧化酶基因。但目前，还没有研究发现特异性的锑氧化酶以及调控锑氧化过程的功能基因。因此，申请人通过比较蛋白质组学等方法分析找出根癌农杆菌GW4(WangQ,QinD,ZhangS,etal.FateofarsenatefollowingarseniteoxidationinAgrobacteriumtumefaciensGW4.EnvironMicrobiol,2014,doi:10.1111/1462-2920.12465)中的锑氧化酶基因sboA，并采用基因敲除、生长氧化实验以及异源表达等方法鉴定该酶锑氧化的功能。sboA基因的发现有利于我们研究锑氧化及抗性的分子机制，填补目前国内外对于锑氧化酶基因研究领域的空白。其异源表达可以为构建基因工程菌修复环境中的锑污染提供理论依据和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于分离和克隆根癌农杆菌GW4中一个编码Sb(III)氧化酶的基因sboA，并对其进行功能验证及应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQID.NO:1中第1-855位碱基所示的序列；该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术通过以下技术方案实施：申请人前期工作是以分离自山西省山阴市地下水沉积物中的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GW4(参见：WangQ,QinD,ZhangS,etal..EnvironMicrobiol,2014,doi:10.1111/1462-2920.12465)为研究对象，在加50μMSb(III)和不加Sb(III)条件下进行比较蛋白质组学研究。经质谱测序后发现，由sboA编码的氧化还原酶表达量上调。通过比对发现该基因编码的蛋白属于SDR家族，能够在类固醇、辅酶因子、碳水化合物、脂类、多元醇、芳香族化合物和氨基酸等的代谢过程中表现氧化还原表型(OdermattAandNashevLG.Theglucocor本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离自根癌农杆菌的锑氧化酶基因sboA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第1‑855位碱基所示的序列。
【技术特征摘要】
1.序列表SEQIDNO：1所示的锑氧化酶基因sboA在氧化环境锑污染中的应用。2.如权利要求1所述的序...
【专利技术属性】
技术研发人员：王革娇，李璟欣，王倩，杨碧荣，李明顺，史曼曼，郭玮，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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