淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用，发酵方法包括：制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；将淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，振荡培养；将发酵液过滤，得到微菌核沉淀。产生的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有抗逆耐储、货架期长和持续控害的特点；微菌核发酵周期短，生产成本低、工艺可控性强，所用原料易于获取。微菌核可以用作制备新型杀虫真菌制剂的活性成分。

【技术实现步骤摘要】
淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用
本专利技术属于生物制剂领域，具体涉及淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用。
技术介绍
南方根结线虫、北方根结线虫及花生根结线虫等植物寄生性线虫，寄生范围广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、胡萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害，是我国蔬菜安全生产的重大威胁，造成蔬菜作物大量减产和质量下降。目前线虫病害的防控主要依靠化学防治，化学农药的大量施用导致线虫病害土壤环境污染、农产品农药残留严重超标、影响蔬菜农产品安全、威胁人民身体健康；还大量杀伤线虫病害天敌，破坏生态平衡。近年来，以绿僵菌、白僵菌为代表的真菌生物农药是国际上微生物农药研究的热点之一，具有使用安全、不污染环境、可扩散流行和线虫病害不易产生抗药性等优点。淡紫拟青霉属于丝状真菌之一，是一种世界性广泛分布的线虫寄生真菌，可以寄生多种线虫，包括根结线虫、胞囊线虫等。但与目前大量使用的绿僵菌、白僵菌制剂相比，淡紫拟青霉传统的孢子菌剂液固两相生产周期长达3周以上、导致生产成本偏高；对环境高温抗逆能力差、货架期短，贮运不便，，田间防效不稳，影响了淡紫拟青霉的产业化与实际应用。而液体发酵产生的芽生孢子因不耐储存，致病力低等缺陷，也不能用于植物寄生性线虫病害的实际防控。 寄生真菌主要类群为丝状真菌，通常产生菌丝体和分生孢子，少数种类也可产生厚垣孢子。真菌微菌核是丝状真菌度过高温、低温或干旱等不良环境的休眠繁殖体，是菌丝体互相纠结，菌丝变异分化产生的外层致密坚硬、有色素沉淀，内层髓质化的组织体，能够在一定的湿度和温度条件下，重新萌发进行产孢。有的植物病原真菌如棉花黄萎病菌、油菜核盘菌等的生活史晚期往往在寄主组织内由菌丝体纠集形成菌核或微菌核。而寄生真菌的菌核或微菌核的诱导形成仅在白僵菌、绿僵菌和野村菌有报导，而淡紫拟青霉微菌核诱导形成未见报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种可大规模生产的淡紫拟青霉微菌核的液体发酵培养方法及其应用，开发生产成本低、侵染活力高、抗逆性强的淡紫拟青霉新侵染结构体，提供一种防治线虫病害的生防制剂，为杀虫真菌制剂的创制提供高质量的母药，解决淡紫拟青霉菌传统孢子菌剂抗逆能力差、货架期短，贮运不便的共性技术难题。 本专利技术的目的是这样实现的: 一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，包括以下步骤: I)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液； 2)微菌核诱导培养:将步骤I中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，25?28°C，200?250rpm振荡培养6?8天； 所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下: KH2PO4:3.0 ?5.0g/L、CaCl2.2Η20:0.6 ?1.0g/L、MgSO4.7Η20:0.4 ?0.8g/L、CoCl2.6Η20:34 ?40mg/L,MnSO4.Η20:14 ?20mg/L、ZnS04.7Η20:12 ?16mg/L ；FeS04.7Η200.1?0.4g/L ;葡萄糖:8?12g/L ;酵母膏:4?6g/L ;蛋白胨:2.0?3.0g/L ； 3)将步骤2振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存。 所述步骤I中制备淡紫拟青霉孢子悬浮液的方法为:将活化的淡紫拟青霉的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在25°C下培养8?10天，用0.1?0.5% Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成孢子悬浮液。 步骤2中所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下: KH2PO4:3.5 ?4.5g/L、CaCl2.2Η20:0.7 ?0.9g/L、MgSO4.7Η20:0.5 ?0.7g/L、CoCl2.6Η20:36 ?38mg/L、MnS04.Η20:15 ?17mg/L、ZnS04.7Η20:13 ?15mg/L ；FeS04.7Η200.1?0.3g/L ;葡萄糖:9?llg/L ;酵母膏:4?6g/L ;蛋白胨:2.0?3.0g/L。 用上述培养方法获得的真菌微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，所述活性真菌为淡紫拟青霉，所述线虫病害病原物为根结线虫或胞囊线虫。应用方式为:将上述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核35°C干燥24-48小时后与硅藻土或高岭土以及助剂混合后成为微菌核细粒剂，用于防治根结线虫或胞囊线虫。所述助剂为蔗糖酯或黄原胶。 本专利技术的有益效果是:本专利技术首次用液体发酵法能稳定大量产生淡紫拟青霉微菌核，产生的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有良好的杀虫活性、抗逆耐储、发酵周期短，生产成本低、货架期长的特点；微菌核作为生物制剂的有效成分，可用于规模化生产新型真菌农药，可以替代分生孢子作为丝状真菌制剂加工的有效成分。该生产过程周期短(5-6d)，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。本专利技术所用的培养液的配制和液体发酵工序可操作性强，重复性好，所用原料易于获取。 【附图说明】 图1为振荡培养7天后得到的淡紫拟青霉微菌核显微镜下100倍图。 图2为干燥后的淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上24h时萌发显微400倍图。 图3为淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上7d的萌发情况图。 图4为淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上14d的产孢情况图。 【具体实施方式】 本专利技术所用的真菌菌株和虫源，如淡紫拟青霉和根结线虫，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如土壤分离或商业途径购买等。 实施例一淡紫拟青霉微菌核诱导培养液配方优化和诱导过程 1、淡紫拟青霉接种体悬浮液制备: 将淡紫拟青霉菌株(来源于重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心)的分生孢子接种到PDA平板上，在25 °C条件下培养12天，用0.1?0.5% Tween-80灭菌液体将平板上的成熟分生孢子洗下，调节分生孢子的浓度，制备成1.0X 18孢子/毫升的孢子悬浮液。 2、诱导培养液配方筛选 I)无机盐离子浓度: 以添加 KH2PO4:4.0g/L、CaCl2.2Η20:0.8g/L、MgSO4.7Η20:0.6g/L、CoCl2.6H20:37mg/L、MnSO4.H20:16mg/L、ZnSO4.7H20:14mg/L 作为培养微菌核的无机盐离子。 2)碳、氮源的选择 选择浓度为10g/L的葡萄糖作为碳源，5g/L酵母膏和2.5g/L蛋白胨作为培养基中的氮源。 3)铁离子浓度的选择 以FeSO4.7H20作为最佳的诱导剂，以0.1g/L,0.2g/L,0.3g/L,0.4g/L四个浓度梯度进行铁离子浓度的确定。 4)诱导培养液的配方: 配制诱导培养液，均含如下成分:KH2P04:4.0g/L、CaCl2.2H20:0.8g/L、MgS04.7H20:0.6g/L、CoCl2.6H20:37mg/L、MnSO4.H20:16mg/L、ZnSO4.7H20:14mg/L ;葡萄糖:10g/L;酵母膏:5g/L;蛋白胨:2.5g/L。除了上述成分，还加入不同浓度的铁离子。将含上述无机盐离子、碳、氮源的培养液组合成4种不同的液体培养基，分别含有FeSO4.7H200.lg/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，25～28℃，200～250 rpm振荡培养6～8天；所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：KH2PO4:3.0～5.0 g/L、CaCl2·2H2O:0.6～1.0g/L、MgSO4·7H2O:0.4～0.8g/L、CoCl2·6H2O：34～40mg/L、MnSO4·H2O:14～20mg/L、ZnSO4·7H2O:12～16mg/L；FeSO4·7H2O 0.1～0.4g/L；葡萄糖：8～12g/L；酵母膏：4～6g/L；蛋白胨：2.0～3.0g/L；3)将步骤2振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存。

【技术特征摘要】
1.一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液； 2)微菌核诱导培养:将步骤I中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，25?28°C，200?250 rpm振荡培养6?8天； 所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下:KH2PO4:3.0 ?5.0 g/L、CaCl2.2Η20:0.6 ?1.0g/L、MgSO4.7Η20:0.4 ?0.8g/L、CoCl2.6Η20:34 ?40mg/L,MnSO4.Η20:14 ?20mg/L、ZnS04.7Η20:12 ?16mg/L ；FeS04.7Η200.1?0.4g/L ;葡萄糖:8?12g/L ;酵母膏:4?6g/L ;蛋白胨:2.0?3.0g/L ； 3)将步骤2振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存。2.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于:步骤I中所述制备淡紫拟青霉孢子悬浮液的方法为:将活化的淡紫拟青霉的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在25°C下培养8?10天，用0.1?0.5% Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成孢子悬浮液。3.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于:步骤2中所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王中康，宋章永，殷幼平，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85