本发明专利技术提供了一株糖苷酶产生菌——黑曲霉(Aspergillus niger)JH-2，及其在生物转化提高积雪草中积雪草酸含量应用；所述黑曲霉是发酵工业中常用菌种，无毒无害，使用安全，转化培养基成分简单，仅需5种盐类成分，生产成本低；黑曲霉JH-2生长迅速、抗杂菌能力强、容易培养，批次稳定；本发明专利技术以积雪草干粉为原料，投入到培养基中转化，既免去积雪草苷分离提取操作，也免去了酶的分离纯化步骤，工艺简单，易于工业化应用；积雪草粉经生物转化处理后，积雪草酸的含量最高可以提高3倍以上。
【技术实现步骤摘要】
黑曲霉JH-2及在生物转化合成积雪草酸中应用(一)
本专利技术涉及一株产糖苷酶的黑曲霉(Aspergillusniger)及其在生物转化提高积雪草中积雪草酸含量应用。(二)
技术介绍
积雪草[Centellaasiatica(L.)Urb]，又名胡薄荷、连钱草、崩大碗、遍地香，为伞形科积雪草属植物，具有清热利湿，解毒消肿之功效。我国民间常用于治疗感冒、扁桃体炎、传染性肝炎、痢疾、跌打损伤、疔疮肿毒、外伤出血等。积雪草中含有三萜皂苷和黄酮类物质，其中起作用的药理成分主要是皂苷及其皂苷元类，包括积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草苷和羟基积雪草酸等，因此这些物质提取和纯化一直是中药积雪草现代化应用研究的重点。近几年来的研究表明，以积雪草酸和羟基积雪草酸等苷元出发，合成一系列苷元衍生物的药理作用明显优于其原始皂苷，可大大提高积雪草酸、羟基积雪草酸等苷元的利用率。积雪草中的积雪草苷和积雪草酸的含量，因产地不同有很大差异，我国产地的积雪草，积雪草苷含量一般为0.17％-1.14％之间，而积雪草酸含量大概只有0.1％左右。研究表明，积雪草苷在人体十二指肠和结肠吸收较差，在空肠和回肠段吸收略有提高，积雪草苷在大肠部分转化为苷元后吸收则显著增加，而积雪皂苷元可以直接被吸收进入动物血液中，积雪草苷可在人的肠道中被一些微生物降解成积雪草酸，发挥其药理作用，但转化率相对较低，大部分积雪草苷不能充分发挥其药理作用。采用化学或生物的方法，可以将积雪草苷上的糖基水解，从而转化为积雪草酸。常用化学方法是酸碱水解法，但酸碱水解容易破坏积雪草苷的苷元的结构，导致转化得率不高，其工业化应用存在一定的困难。生物转化也可以实现这一转化反应，由一种特异性的糖苷酶，在温和的条件下，便可专一性地水解积雪草苷上的葡萄糖残基，得到积雪草酸。近些年来有报道采用微生物转化积雪草苷的粗提物，可以取得较好的转化率，但报道的方法都需要对积雪草苷进行粗提，这就增加了工艺的复杂性。由此可见，如直接以积雪草为原料，利用微生物发酵法处理积雪草，将其中的积雪草苷转化为积雪草酸，积雪草酸的含量可大幅提高，而且微生物分泌的酶对积雪草中的糖类物质降解，也有利于积雪草酸的提取。经过转化处理的积雪草，即可作为中药材应用于临床治疗，疗效将显著提高；也可以作为积雪草酸提取的原料。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株糖苷酶产生菌——黑曲霉(Aspergillusniger)JH-2，及其在生物转化提高积雪草中积雪草酸含量的应用，经转化处理的积雪草中，积雪草酸的含量可以提高3倍以上，工艺具有成本低、流程简单、转化率高等优点。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株--黑曲霉(Aspergillusniger)JH-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNo：M2014398，保藏日期2014年9月5日。本专利技术所述黑曲霉JH-2，是从以积雪草粉为微生物来源的富集培养物中分离和筛选得到的优良菌株，本专利技术所述积雪草[Centellaasiatica(L.)Urb]，又名胡薄荷、连钱草、崩大碗、遍地香，为伞形科积雪草属植物，具有清热利湿，解毒消肿之功效，按照《中国药典》为伞科植物积雪草的干燥全草，夏、秋二季采收，除去泥沙，晒干。所述黑曲霉JH-2的菌落特征如下：在平板培养基上，30℃条件下培养3天，菌落初期为白色，后变成黄色直至黑褐色绒毛状，背面中央略带黄褐色。分生孢子头黑褐色放射状，顶囊球形，直径700～800μm，双层分生孢子小梗，长短不一。分生孢子褐色球形，直径2.5～4.0μm。所述黑曲霉JH-2的28srRNA的部分核苷酸序列如下(SEQIDNO:1所示)：GGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGTGTCCGTGCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACG。本专利技术还涉及所述的黑曲霉(Aspergillusniger)JH-2在生物转化合成积雪草酸中的应用，用该菌株发酵处理积雪草粉，其中的积雪草酸的含量可以提高3倍以上，所述的应用是以中药材积雪草粉为原料，以黑曲霉JH-2为酶源，以发酵培养基为反应介质，在28～32℃进行微生物转化反应，反应结束后，过滤，取滤饼干燥，即获得积雪草酸含量提高3倍以上的积雪草。进一步，所述转化反应条件为：在体积装液量20～40％、28～32℃、200r/min条件下培养4～6天。进一步，所述积雪草的用量以发酵培养基体积计为0.04～0.1g/ml。进一步，所述积雪草在加入前先粉碎过75目筛，再于160℃干热灭菌2h。进一步，所述滤饼干燥条件为85℃干燥24h。具体的，所述黑曲霉JH-2在生物转化合成积雪草酸中应用为：将黑曲霉JH-2菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至发酵培养基中，加入经粉碎过75目筛、160℃干热灭菌2h的积雪草粉，在体积装液量20％情况下于28～32℃、200r/min培养4～6天后，过滤除去培养基，滤饼经85℃、24h烘干即为富含积雪草酸的积雪草。本专利技术所述发酵培养基组成如下：(NH4)2SO44～6g/L，NaCl3～5g/L，KH2PO43～5g/L，MgSO40.5～1.0g/L，MnSO40.5～1.0g/L，pH4.0～6.0。优选发酵培养基组成为：(NH4)2SO46g/L、NaCl5g/L、KH2PO45g/L、MgSO41.0g/L、MnSO41.0g/L，溶剂为去离子水，pH5.0。所述黑曲霉JH-2菌株在转化培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或再经过种子培养基扩大培养，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行生物转化，具体的，所述斜面活化、种子扩大培养及生物转化培养的方法如下：(1)将黑曲霉JH-2菌种孢子接种于斜面培养基，于28～32℃恒温培养箱中培养3～5d，得到活化后的黑曲霉JH-2菌种；所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，其组成和配制方法为：马铃薯100～200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20～30m本文档来自技高网...
【技术保护点】
黑曲霉(Aspergillus niger)JH‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No：M2014398，保藏日期2014年9月5日。
【技术特征摘要】
1.黑曲霉(Aspergillusniger)JH-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNo：M2014398，保藏日期2014年9月5日。2.一种权利要求1所述黑曲霉JH-2在生物转化合成积雪草酸中应用，其特征在于所述的应用是以积雪草为原料，以黑曲霉JH-2为酶源，以发酵培养基为反应介质，在28～32℃进行微生物转化反应，反应结束后，过滤，取滤饼干燥，即获得富集积雪草酸的积雪草。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述黑曲霉JH-2在接种发酵培养基前先经过活化和扩大培养，所述活化和扩大培养方法为：(1)活化培养：将黑曲霉JH-2菌种接种于斜面培养基，于28℃培养3天，获得斜面孢子菌体；所述的斜面培养基为PDA培养基；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉JH-2斜面孢子至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养2天，得到种子液；所述种子培养基为PDB培...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，金航，李靓，陈虹，应国清，王鸿，易喻，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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