一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术通过pH指示剂结合高通量筛选，能够从大量菌株中筛选获得有机酸产量相对较高的菌株，简化了整个筛选过程和提高了筛选效率。本发明专利技术还将pH指示剂结合的高通量筛选与常规育种方法相结合，获得了一株α-酮戊二酸的高产菌株，相较于原始菌，该菌株的产量在摇瓶上提高了51.8％，在3L发酵罐上提高了45.4％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物
 
技术介绍
α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循环中一个关键的中间代谢产物，是氨基酸和蛋白质代谢过程中主要的前提物质，广泛应用于食品、医药、农业和化妆品等领域。但低生产效率这一缺陷严重地限制了发酵法生产α-酮戊二酸在工业上的发展和应用，因此，对α-酮戊二酸高产菌株的筛选迫在眉睫。 目前，有机酸的检测一般使用气相色谱法或者HPLC法，用此方法来筛选菌株存在繁琐、效率低等缺点。还没有关于高通量筛选α-酮戊二酸高产菌株方面的相关报道。 本专利技术通过利用有机酸生产过程中pH变化这一特性，结合pH指示剂和高通量技术建立了高效、快速筛选有机酸高产菌株的方法。 
技术实现思路
本专利技术提供一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，是先将待筛选菌株于含有变色范围包含了pH 2.6～5.2中的任一pH值的pH指示剂的培养基中进行初筛，选取变色圈较大的菌株于高通量孔板中发酵后，再加入变色范围包含了pH 1.4～3.2中的任一pH值的pH指示剂进行复筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。 所述方法，是先用含有溴甲酚绿或百里酚蓝或刚果红的培养基对待筛选菌株进行初筛，挑选变色圈较大的菌落，于高通量孔板中发酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶红或橙黄ⅣpH指示剂，进行复筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。 所述有机酸可以是以下任意一种：柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、苯丙酮酸、a-酮异己酸、延胡索酸、脂肪酸、草酰乙酸。 所述有机酸在本专利技术的一种实施方式中是α-酮戊二酸。 所述溴甲酚绿或百里酚蓝或刚果红，在培养基中的添加量为常规添加量。 所述溴甲酚绿指示剂的配制方法：溴甲酚绿0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液2.8ml使溶解，再加水稀释至200ml，变色范围pH 3.6～5.2。 所述溴甲酚绿，在本专利技术的一种实施方式中，是直接在培养基中加入终浓度在0.2-0.5g/L的固体溴甲酚绿。在高产有机酸菌株的培养基中，溴甲酚绿变色明显，而且对细胞没有毒害作用。 所述初筛，可以是将菌株点种、涂布或者划线在平板上。 所述高通量孔板可以是96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一种具有高通量筛选作用的培养器皿。 所述喹哪啶红pH指示剂的配制方法：取喹哪啶红0.1g，加甲醇100ml使溶解，即得。变色范围pH1.4～3.2(无色→红)。 所述加入喹哪啶红pH指示剂的量，为上清体积1/25至1/100。 所述加入橙黄ⅣpH指示剂的量，为上清体积1/50至1/200。 所述加入喹哪啶红或橙黄ⅣpH指示剂后，反应5—60min。 所述加入喹哪啶红pH指示剂的量，在本专利技术的一种实施方式中，为上清体积的1/50。 所述加入橙黄ⅣpH指示剂的量，在本专利技术的一种实施方式中，为上清体积的1/200。 所述上清，在本专利技术的一种实施方式中，是将发酵液离心后获得的。 所述复筛，在本专利技术的一种实施方式，还可以是加入喹哪啶红pH指示剂后，测定OD520，数值相对较小的即为复筛得到的菌株。 所述复筛，在本专利技术的一种实施方式，还可以是加入橙黄ⅣpH指示剂后，测定OD520，数值相对较大的即为复筛得到的菌株。 本专利技术还提供一种利用所述高通量筛选方法来筛选α-酮戊二酸高产菌株的方法，是先将待筛选菌株于含有溴甲酚绿的培养基中进行初筛，挑取变色圈较大的菌落，再于高通量孔板中发酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶红pH指示剂，选取变色较大的菌株为复筛得到的菌株，对复筛得到菌株进行发酵验证，即得到α-酮戊二酸相对高产菌株。 所述菌株是任意一种：能生产有机酸的菌株。 所述高产菌株，在本专利技术的一种实施方式中，是在发酵过程中能使发酵液的pH能够达到3.6以下的菌株。 所述菌株，在本专利技术的一种实施方式中，是解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica。 所述菌株，在本专利技术的一种实施方式中，是Yarrowia lipolytica CCTCC NO：M207143及其经ARTP诱变后得到的菌株。 所述复筛，在本专利技术的一种实施方式，还可以是加入喹哪啶红pH指示剂后，测定OD520，数值相对较小的即为复筛得到的菌株。 所述加入喹哪啶红pH指示剂的体积为上清体积的1/50，上清中α-酮戊二酸的量为0.6g/L-4.8g/L时，反应30min后，OD520与α-酮戊二酸量存在线性方程：Y＝0.02842X+0.2039。 所述复筛，本领域技术人员，可以通过调整发酵时间、稀释或者浓缩发酵液等方法，使 上清中α-酮戊二酸的量在某一合适范围，以适于用喹哪啶红pH指示剂进行筛选。 所述α-酮戊二酸高产菌株的筛选方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：将多株Yarrowia lipolytica于含有溴甲酚绿指示剂的培养基中进行培养，选取变色圈相对较大的菌株为初筛得到的菌株，再于高通量孔板中进行发酵，发酵液离心后，取上清加入体积为上清1/50的喹哪啶红pH指示剂反应30min，测定OD520，选取OD520相对较小的菌株作为复筛得到的菌株，再于发酵培养基中培养后进行验证。 所述高通量深孔板中进行发酵，在本专利技术的一种实施方式中，是指在发酵培养基，于28℃，900rpm下，发酵96h。 所述验证，是指采用高效液相色谱测定菌株发酵后α-酮戊二酸产量，以确定复筛菌株是相对高产菌株。 本专利技术建立了一种新型筛选方法，结合了pH指示剂的高通量筛选的方法，极大地简化了整个筛选过程。本专利技术方法能够快速地从大量菌株中筛选获得高产有机酸的菌株。本专利技术还可以与其他育种方法(比如说诱变育种、代谢育种技术、代谢工程改造等)结合起来，从大量菌株中筛选目标菌株。此外，本专利技术还结合了恒温常压等离子体诱变技术(ARTP)、pH指示剂和高通量筛选技术，提高α-酮戊二酸的产量和降低副产物丙酮酸的产量，本专利技术经过多批次的诱变再筛选，得到了一株α-酮戊二酸的高产菌株，同时相应地降低了发酵副产物丙酮酸的产量和提高整个发酵过程的生产效率。 附图说明图1：OD520与有机酸产量的线性关系；A为喹哪啶红1/25；B为喹哪啶红1/50；C为喹哪啶红1/100；D为橙黄Ⅳ1/50；E为橙黄Ⅳ1/100；F为橙黄Ⅳ1/200。 具体实施方式本专利技术的待筛选菌株，可以是分离自自然界的初筛产物，也可以是人工诱变或者改造的产物。本专利技术同样适用于从有机酸产值水平已经较高或偏低的菌株中快速筛选有机酸产量相对较高的菌株，因为首先高通量孔板中有机酸的产量较低，不会达到摇瓶或发酵罐中一样的高产值，另外，为获取目标产物为目的的孔板培养技术是本领域所熟知的，根据感兴趣的目标菌种，相关的种子培养基、发酵培养基、培养条件和时间等均可以参照现有技术中的相关指导，予以采纳或调整与改进，这些调整与改进都属于本领域技术人员的常规技能，比如说本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，是先将待筛选菌株于含有变色范围包含了pH2.6～5.2中的任一pH值的pH指示剂的培养基中进行初筛，选取变色圈较大的菌株于高通量孔板中发酵后，再加入变色范围包含了pH1.4～3.2的任一pH值的pH指示剂进行复筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。

【技术特征摘要】
1.一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，是先将待筛选菌株于含有变色范围包含了pH
2.6～5.2中的任一pH值的pH指示剂的培养基中进行初筛，选取变色圈较大的菌株于高
通量孔板中发酵后，再加入变色范围包含了pH1.4～3.2的任一pH值的pH指示剂进行复
筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是先用含有溴甲酚绿或百里酚蓝或刚
果红的培养基对待筛选菌株进行初筛，挑选变色圈较大的菌落，于高通量孔板中发酵后，
取发酵液上清，加入喹哪啶红或橙黄ⅣpH指示剂进行复筛，选取变色较大的菌株进行发
酵验证。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机酸可以是以下任意一种：柠檬酸、
异柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、苯丙酮酸、a-酮异己酸、延胡索酸、
脂肪酸、草酰乙酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高产菌株是在发酵过程中能使发酵液的
pH能够达到3.6以下的菌株。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，曾伟主，李江华，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32