一种利用D-乳糖醇实现重组蛋白高效诱导表达的方法技术

一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，属于基因工程药物制备技术领域。其是取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，37℃，180～220r/min过夜培养；当菌液的紫外吸光值OD600为0.3～0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇，使D-乳糖醇的终浓度为0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃条件下诱导3～8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。实验表明D-乳糖醇为诱导剂与IPTG诱导效果无差异，D-乳糖醇为食品添加剂，无毒性，不被菌体降解，不需多次添加，因此乳糖醇可以代替IPTG作为以Lac为启动子的基因工程重组蛋白的理想诱导剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程药物制备
，具体涉及一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法。
技术介绍
乳糖操纵子作为一种可诱导的负调控型操纵子，是目前研究的最为详尽的基因操纵子，已被广泛应用于大肠杆菌工程菌株的构建中。IPTG(异丙基-β-D巯基半乳糖苷)诱导条件简单，是一种高效的乳糖(lac)及其衍生物的启动子诱导剂，是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质，可以直接进入大肠杆菌细胞内部发挥诱导作用，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，它是一种非代谢性的诱导物，不会被菌体所消耗，只需要极少量的存在就能稳定地诱导乳糖启动子的转录。但其具有潜在的毒性，对菌体生长有一定的抑制作用，且价格较昂贵。乳糖是一种二糖，作为原核细胞的常用碳源，是乳糖操纵子控制的细菌自身系列酶的天然底物，对乳糖操纵子具有天然的诱导作用，且价廉易得、无毒无害；但由于乳糖可以被细胞作为碳源代谢利用，其浓度是动态变化的，需要不断向培养基中添加乳糖。其诱导机制比IPTG更为复杂，需要借助于乳糖透过酶(Permase)的作用进入细胞,然后经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖(Allolactose)才能起到诱导剂的作用，诱导条件不易掌握，同IPTG相比，乳糖作为诱导剂对于乳糖操纵子的诱导调控过程更为复杂。乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)是一种保健型甜味剂，在自然界中并不存在，它是以乳糖为原料，经还原反应后精制纯化而得，可用作食品添加剂，而乳糖醇具有同IPTG相似的化学结构，极易溶于水，微溶于乙醇，且稳定性较强，在酸，碱，光及高温条件下仍能保持稳定性，安全性较高也可作为诱导剂，且无毒无害不被菌体所替代。乳糖醇所具有的价廉易得，无毒高效的特点，使得利用D-乳糖醇代替IPTG作为诱导剂的研究，对于各种利用原核表达系统进行重组蛋白的大规模生产，具有十分重要的现实意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足之处，提供一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法。本专利技术所述的一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其步骤如下：(1)取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，37℃，180～220r/min过夜培养；(2)当菌液的紫外吸光值OD600为0.3～0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇(阿拉丁，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)，使D-乳糖醇的终浓度为0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃条件下诱导3～8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。上述方法中所述的活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液，由如下步骤制备得到：(1)果糖苷酶工程菌(Escherchia.coil BL21(DE3)(革兰氏阴性球菌))的构建：此工程菌参照NCBI数据库中公布的Thermotoga neapolitanaDSM4359中的果糖苷酶基因序列GeneID：7378529，利用PrimerPremier5.0软件设计1对引物用于扩增果糖苷酶基因：P1：CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC(NheI)；P2：TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。按照细菌基因组DNA提取试剂盒(百泰克)说明书提取Thermotoga neapolitana DSM4359基因组DNA，以提取的DNA为模板，用引物P1和P2进行扩增。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s、55℃退火35s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，反应完成后PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后将含有目的基因的PCR产物参照柱式DNA胶回收试剂盒说明书(上海生工)进行纯化回收1305bp处条带。用限制性内切酶NheI和EcorI对回收产物进行双酶切处理，之后通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行比较并切胶回收双酶切产物。酶切条件为：8μL纯化的PCR产物加入1μL NheⅠ、1μL EcorI、2μL缓冲液、8μL去离子水，混合37℃下保温12小时，进行2％的琼脂糖凝胶电泳。对表达载体pET-28a(+)质粒做上述同样的处理并切胶回收双酶切产物中的大条带产物。混合目的基因片段和pET-28a(+)质粒，加入T4DNA连接酶(TaKaRa)，16℃过夜连接。连接反应体系如下:10×连接Buffer1μL、回收的目的基因4μL、pET28a(+)表达载体1μL、T4DNA连接酶0.4μL，加水补足至10μL，将上述试剂冰浴加入无菌PCR管中，小心混匀，瞬间离心后，16℃过夜连接。连接产物转化入Escherchia.coil BL21(DE3)感受态细胞。挑取数个菌落分别接种于5mL含卡那霉素(Kan)10μg/mL的LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养。提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。将得到的转化入带有果糖苷酶基因的pET-28a(+)的液态阳性工程菌Escherchia.coil BL21(DE3)(革兰氏阴性球菌)-80℃保存备用。(2)果糖苷酶工程菌的活化及扩培：取-80℃保存的工程菌在含Kan(10μg/mL)的LB固体培养基(LB液体培养基加入1.5％(m/v)琼脂粉)划线，37℃恒温箱过夜培养。然后挑经活化的工程菌单菌落接种到LB液体培养基，200～300r/min，37℃过夜培养，从而得到经扩培后的菌液。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术成功运用D-乳糖醇代替IPTG作为诱导剂诱导目的蛋白的表达。(2)本专利技术的目的蛋白表达水平高，目的蛋白的表达量与IPTG诱导蛋白量相当。(3)本专利技术除了可以诱导果糖苷酶外，还能诱导所有带有Lac启动子的载体工程菌所表达的目的蛋白。(4)本专利技术所述的发酵方法简便，发酵时间短，生产成本低，此外，无IPTG存在，无毒，后处理简单。附图说明图1：D-乳糖醇在不同浓度下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。图2：D-乳糖醇在不同时间下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。图3：D-乳糖醇在不同温度下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。图4：IPTG和D-乳糖醇对果糖苷酶活力的影响效果示意图。D-乳糖醇的诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用D‑乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其步骤如下：(1)取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，37℃，180～220r/min过夜培养；(2)当菌液的紫外吸光值OD600为0.3～0.5时，添加诱导剂D‑乳糖醇，使D‑乳糖醇的终浓度为0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃条件下诱导3～8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。

【技术特征摘要】
1.一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其步骤如
下：
(1)取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接
种接种于LB液体培养基，37℃，180～220r/min过夜培养；
(2)当菌液的紫外吸光值OD600为0.3～0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇，使
D-乳糖醇的终浓度为0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃条件下诱导
3～8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。
2.如权利要求1所述的一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表
达的方法，其特征在于：活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液由如下步骤制备
得到，
(1)果糖苷酶工程菌的构建：
参照NCBI数据库中公布的Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷
酶基因序列GeneID：7378529，利用PrimerPremier5.0软件设计1对引物用于
扩增果糖苷酶基因：
P1：CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC
(NheI)；
P2：TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)；
按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取Thermotoga neapolitana 
DSM4359基因组DNA，以提取的DNA为模板，用引物P1和P2进行扩增；反应
程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s、55℃退火35s、72℃延伸90s，30
个循环；72℃延伸10min，反应完成后PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；
然后将含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕云枫，姜仁凤，沈明浩，徐琳琳，陈萍，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22