一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：(1)根据BVDV-E2基因序列，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果分析；(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化；(3)抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000沉淀法提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析，ELISA效价监测，Western blotting特异性分析。本发明专利技术提取的抗E2-IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，涉及一种特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法。
技术介绍
牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea，BVD)，又称牛病毒性腹泻.粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的多种临床症状如高热、白细胞减少、沉郁、下痢、大量流涎、减奶以至停奶、反刍停止、结膜炎、口腔粘膜出血并出现溃疡症状等的一种疾病。孕牛可能流产、产死胎和畸形胎等。还可引起牛的免疫耐受与持续性感染，免疫抑制。该病在世界范围内广泛流行，给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失，每年死于此感染的牛不少于500万头，同时由于其持续感染等造成的间接损失也严重阻碍了畜牧业的发展。目前国内外主要的检测方法有：PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点，已广泛用于多个领域。近几年来，又有新的发展。RT-PCR可以敏感快速地从组织、排泄物、血清、细胞培养物等检出BVDV而且可以区分猪瘟和羊边界病毒，利用该方法还可以进行BVDV核酸序列的研究。病毒分离技术是一种最基本、最准确的检测方法。常用来分离BVDV用的细胞是牛鼻气管细胞(BT)和牛肾细胞传代细胞株(MDBK)。电镜技术成为病毒学研究、快速诊断不可或缺的手段。这种方法快捷、方便、直观。然而电镜观察需要高含量的病毒粒子，需要对病毒进行浓缩。抗体的检测可以为免疫接种程序的制定和临床诊断提供依据。相比其它抗体检测方法，胶体金试纸条和ELISA试剂盒操作简便，价格低廉，在临床上被广泛应用，胶体金试纸条和传统的HI相比，其敏感性和特异性达到97.1％，76.6％，而ELISA试剂盒阳性检出率达到85％，和HI符合率达到80％。IgY技术，即通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从卵黄中获得特异性多克隆抗体。相对于哺乳动物抗体，IgY技术避免了常规的动物采血，满足动物福利要求，且抗体产量大，制备相对简单，经济优势明显，更为重要的是，IgY还具有一系列生物学与抗体特性与优势。近年来，IgY抗体在医药、生物
都呈现出良好的发展势头。IgY已广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，特异性、敏感性较好，同时能够降低BVDV治疗成本和基于IgY检测试剂盒的研制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，以便用于BVDV病毒的检测与治疗。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案实现：一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5.0软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因(1040bp)，连接至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化。pMD18-T-E2和pET-32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21(DE3)pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明，构建成功pET-32a-E2表达载体，重组E2蛋白在0.75mmol/L的IPTG诱导5h，主要以包涵体形式存在，43ku附近出现片段，表达产物经Ni+柱纯化后。Western blot表明重组蛋白具有良好的反应原性。(3)抗E2-IgY抗体的制备。纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。间接ELISA测定免疫后抗E2-IgY抗体效价，Western blot鉴定所获抗E2-IgY的特异性。结果表明，IgY抗体经SDS-PAGE分析包含两条链，重链(65ku)和轻链(19ku)；四免后，抗E2-IgY效价达到1∶128000，Western blot表明，所制备IgY抗体可特异性结合E2蛋白。所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300μg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250μg/只，所属禽类为鸡。所述提取IgY的方法如下；(1)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS(pH 7.4)按照体积比1∶2进行稀释；(2)向稀释液加入质量体积比为3.5％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；(4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；(5)将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析过夜，获得IgY，并保存在-20℃备用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的方法提取的重组蛋白具有良好的反应原性；(2)本专利技术提取的抗E2-IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反应；(3)提取方法相对简单，抗体产量大，制备成本低。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作详细说明。一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析。根据GenBank报道的有关BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5.0软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因(1040bp)，连接至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化。pMD18-T-E2和pET-32a载体使用BamHI和XhoI双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21(DE3)p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV‑E2基因序列，利用软件设计一对引物，PCR扩增BVDV‑E2基因，连接至pMD18T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析；(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18T和pET‑32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET‑32a‑E2表达载体，转化Bal21(DE3)pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化；(3)抗E2‑IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫白色来杭产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS‑PAGE分析。

【技术特征摘要】
1.一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特
征在于：包括以下步骤：
(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2
基因序列，利用软件设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至
pMD18T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶
切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析；
(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18T和pET-32a载体
使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，
转化Bal21(DE3)pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG
诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进
行纯化；
(3)抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫白色来杭产蛋鸡，
使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。
2.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性
IgY的制备方法，其特征在于：步骤(1)中根据GenBank报道的有关
BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5.0软件，设计一对引物，PCR扩
增BVDV-E2基因，为1040bp，连接至pMD18T载体，转化DH5α感受
态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。
3.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性
IgY的制备方法，其特征在于：步骤(2)中表达产物经SDS-PAGE和
Western blot分析后使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。
4.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性
IgY的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，对提取特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小莺，王媛，任昊，江雪梅，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61