一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法技术

本发明专利技术属于动物生物医药工程领域，具体公开了一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法。本发明专利技术制备出的亚单位疫苗直接作为口服疫苗免疫小鼠，能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答。该疫苗在胃肠部不易降解，免疫效果显著，制备工艺简单，对减轻猪流行性腹泻病毒对养猪业的危害起到积极的作用，对促进养猪业健康发展具有重要的实践意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物生物医药工程领域，更具体地，涉及一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一种单股、正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronviridae)，冠状病毒属(Coronavims)。感染PEDV是猪病毒性腹泻的主要原因之一，主要的特征为严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和体重减轻等，仔猪死亡率的居高不下使得PEDV感染成为中国养猪业损失的一大因素。PEDV在被发现后直至今日，不但没有被有效控制，反而成了影响全世界养猪业的重大病毒，造成巨大的经济损失。PED在亚洲的爆发引起极高的死亡率，有研究显示日本1993～1994年爆发PED时，5个猪场仔猪死亡数就超过一万，死亡率在30%～60%；据报道从2010年2月到2011年11月，我国爆发PED引起的仔猪死亡数在五万以上，死亡率高达90%～100%。2013年，美国也首次报道了PEDV的存在，2014年持续爆发与流行。目前对于PED的预防主要是接种疫苗，虽然国内PEDV的灭活苗及弱毒活疫苗得到了广泛的推广和应用，在一定程度上减少了PED的发病率，但仍无法完全控制。原因在于PEDV主要通过肠道感染猪，具有很明显的肠道组织噬性。粘膜sIgA抗体对经消化道、呼吸道、生殖入侵的粘膜感染病毒具有中和作用。因此开发产生粘膜sIgA抗体的疫苗对预防PEDV有重要的作用。针对此特点，国内开发的刺激肠道粘膜，产生粘膜抗体的主要疫苗为弱毒苗、基因重组的活菌疫苗以及亚单位疫苗。弱毒苗存在弱毒反强的风险，有可能造成二次危害，重组菌活疫苗的难点在于不易把控活菌的数量，容易失活，而亚单位疫苗口服时，在通过胃肠道的时候，容易受到酶水解而失去效力。
技术实现思路
针对现有技术中猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗无法口服，且在胃肠道中容易降解的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗制备方法。本专利技术是通过以下技术方案予以实现的。    一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1. 将脱乙酰度为80~85%的壳聚糖溶于0.5~0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； S2. 取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为50~100μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15~20 min；S3. 将1~2 ml浓度为0.2%（W/V）的三聚磷酸钠，加入到S2溶液中，继续搅拌5 ~10min即得疫苗。    优选地，S1所述壳聚糖的脱乙酰度为85%。    优选地，S1所述壳聚糖溶液配置时将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶解于0.5%（v / v）乙酸中。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果本专利技术制得的猪流性腹泻病毒亚单位疫苗可以口服，并且在胃肠部不易降解，能够刺激机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，免疫效果显著，制备工艺简单，制备条件温和，只需要进行常规的搅拌和常温条件即可制备，制备成本低廉，有利于大规模推广。另外，现有技术报道利用0.3~1%（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，包封蛋白或核酸的包封率都在80%左右，但是，本专利技术发现，对于猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，必须用脱乙酰度为80~85%，浓度为0.5~0.6（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，才能达到良好的包封率。分析原因可能与猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白的空间结构和蛋白大小有关。附图说明图1为实施例5受刺激脾细胞培养上清GM-CSF浓度图2为实施例5受刺激脾细胞培养上清IFNγ浓度图3为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL2浓度图4为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL4浓度图5为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL5浓度图6为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL6浓度图7为实施例5受刺激脾细胞培养上清IL10浓度图8为实施例5受刺激脾细胞培养上清TNFα浓度。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。实施例1     壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于0.5%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； S2.取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为60μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15 min；S3. 将2 ml浓度为0.2%（W/V）的三聚磷酸钠，加入到S2溶液中，继续搅拌5min即得疫苗。其中，60μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白是用0.9%的生理盐水稀释500 μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白原液获得的，而猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白原液是华南农业大学动物科学学院家禽研究室按照常规的真核表达的方法获得的。实施例2    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为80%的壳聚糖溶于0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液；     其他步骤同实施例1。实施例3    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于0.3%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液；     其他步骤同实施例1。实施例4    壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的制备：S1.壳聚糖溶液的配置：将脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于1%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 其他步骤同实施例1。利用BCA法测定实施例1~4制备得到的壳聚糖包被的猪PEDV亚单位疫苗的包封率，BCA方法的步骤参考本
常规的方法即可，测定结果：实施例1~4所述疫苗的包封率分别为（86.31±2.05）%、（84.56±3.23）%、（70.12±1.96）%、（69.62±3.17）%。由实施例1、3、4的结果可知，醋酸溶液的浓度置显著影响了包封率。现有技术中报道，利用0.3~1%（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，包封蛋白或核酸的包封率都在80%左右，但是，本专利技术发现，对于猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，必须用脱乙酰度为80~85%，浓度为0.5~0.6（v / v）的乙酸溶液来溶解壳聚糖，才能达到良好的包封率。分析原因可能与猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白的空间结构和蛋白大小有关。实施例5将实施例1制备的壳聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 将脱乙酰度为80~85%的壳聚糖溶于0.5~0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； S2. 取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为50~100μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15~20 min；S3. 将1~2 ml浓度为0.2%（W/V）的三聚磷酸钠，加入到S2溶液中，继续搅拌5 ~10min即得疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种可口服的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将脱乙酰度为80~85%的壳聚糖溶于0.5~0.6%（v / v）乙酸中，制备0.2%（w/v）壳聚糖溶液； 
S2. 取4 ml步骤S1制备的壳聚糖溶液，边搅拌边逐滴加入1 ml浓度为50~100μg/mL猪流行性腹泻病毒抗原COE蛋白，蛋白加完后再搅拌15~20 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，磨健悦，曾喜多，孙宝丽，毕英佐，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44