使用RNAi控制有害生物的方法技术

本发明专利技术涉及使用双链RNA分子来控制有害生物侵袭的方法。本发明专利技术提供了产生表达所述双链RNA分子的转基因细胞的方法，以及含有此类分子或经此类分子处理过的组合物和商品产品。

【技术实现步骤摘要】
本申请为2006年9月18日提交的、专利技术名称为使用RNAi控制有害生物的方 法的PCT申请PCT/IB2006/004008的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为 2008 年 5 月 16 日，申请号为 200680042927. 5。 专利
-般而言，本专利技术涉及对有害生物（pest)侵袭的遗传学控制。更具体地，本专利技术 涉及重组技术，用于阻遏或抑制有害生物中祀编码序列的表达。 导论 昆虫和其它有害生物可能通过其叮咬或刺导致损伤甚至死亡。此外，很多有害生 物传播导致疾病的细菌和其它病原体。例如，蚊子传播导致拒疾、黄热病、脑炎和其它疾病 的病原体。腹股沟结鼠疫或黑死病是感染大鼠和其它晒齿动物的细菌导致的。用于控制显 微有害生物侵袭的组合物已经W抗生素、抗病毒和抗真菌组合物的形式提供。通常地，其被 应用于有害生物驻留的表面，或者W小丸、散剂、片剂、糊剂或胶囊剂的形式施用给受侵袭 的动物。。 商业作物通常是昆虫攻击的目标。过于数十年来已经做出了相当的进展，开发出 了高效的方法和组合物用于控制植物中的昆虫侵袭。化学杀虫剂对于根除有害生物侵袭非 常有用。然而，使用化学杀虫剂有若干种缺点。它们不仅有可能对于环境有害，而且，化学 杀虫剂还不是选择性的，其对于非祀标动物群和植物群可能造成损害。化学杀虫剂持续存 在于环境中，通常代谢得很慢（如果有代谢）。它们在食物链中积累，特别是高等食肉动物 物种中。该些化学杀虫物质的积累导致对该些物质抗性的发展，并且它们可能在进化梯中 高等的物种中，成为诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害的遗传修饰。 因为与化学杀虫剂相关的该些危险，已经开发了生物学手段来控制有害生物侵 袭。例如，使用来自苏云金芽抱杆菌炬acillus thuringiensis)的化y3A蛋白质进行生物 学控制已能有效控制马铃墓甲虫幼虫，其可作为喷雾到叶上的制剂或者作为在马铃墓叶中 表达的制剂来使用。备选的生物剂是双链RNA (dsRNA)。过去数年来，通过RNA干扰在多细 胞生物中对基因的下调（也称基因沉默）已成为良好完善的技术。 RNA干扰（RNAi)提供了用于控制基因表达的潜在的强大工具，因为其能特异性祀 向选择，并且W显著高的效率进行祀向mRNA遏制。RNAi指通过短干扰RNA(SiRNA)介导 的序列特异性转录后基因沉默狂amore，P.等人，Cell 101 :25-33(2000) ;Fire，A.等人， 化1:脚6 391 :806(1998);化milton 等人，Science 286,950-951(1999) ;Lin 等人，化1:脚6 402 ; 128-129 (1999))。虽然RNAi的机制还没有获得完全表征，但是人们认为，细胞中dsRNA 的存在通过激活核糖核酸酶III切酶来触发RNAi Gamore,P.等人，（2000) ;Hammond等人， 化化re 404,293(2000))。切酶将的dsRNA加工为短片段，其被称为短干扰RNA(SiRNA), 其为大约21至大约23个核巧酸长，包含约19个碱基对双链体狂amore等人，（2000); E化ashir等人，Genes Dev.，15,188 (2001))。递送进细胞后，SiRNA分子与内切核酸酶复合 物相关联，该复合体通常被称为RNA诱导性沉默复合物巧ISC)，其将SiRNA的反义链和细胞 mRNA基因祀带到一起。RISC切割mRNA，然后所述mRNA释放并被降解。重要地，然后RISC 能降解祀mRNA的额外拷贝。 因此，本专利技术提供了通过阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来控制有 害生物侵袭的方法和组合物。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了经分离的多核巧酸序列，其包含SEQ ID NO ;1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、 208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、 498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、 621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、 888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、 1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、 1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、 1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、 1688、1690、1脚2、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、 2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、 2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、 2476和2481中示出的核酸序列。在一种实施方案中，从多核巧酸序列的表达产生双链核糖 核巧酸序列，其中，有害生物与所述核糖核巧酸序列的接触能抑制所述有害生物的生长。在 又一实施方案中，所述序列的接触抑制与所述序列充分互补的核巧酸序列的表达。在另一 实施方案中，用该多核巧酸转化细胞。在还一实施方案中，所述细胞是细菌、酵母或藻类细 胞。在再一实施方案中，食物产品，例如，胆藏谷类、宠物食品或粉末巧克力，包含经该多核 巧酸转化的细胞。在又一实施方案中，组合物，例如喷雾剂、粉末、团块（pellet)、凝胶、胶 囊、食物产品、衣物袋和图书包含该多核巧酸。在又一实施方案中，本专利技术提供了包含该多 核巧酸的杀虫剂。在另一实施方案中，本专利技术提供了保护物体免受有害生物侵袭的方法，所 述物体例如木材、树、图书粘合物、布和食物胆藏容器，所述方法包括用包含所述多核巧酸 的组合物处理所述表面。 在另一实施方案中，本专利技术提供了与 SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483本文档来自技高网...

【技术保护点】
经分离的双链RNA分子，其包含经退火的双链，其中所述退火的链的至少一条链包含选自以下的多核苷酸：(a)与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因通过以下任一所示：SEQ ID NO:11、253、517、605、797、892、1089、1115、2104、1、3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、159、160、161、162、247、249、251、255、257、259、513、515、519、521、601、603、607、609、793、795、799、801、888、890、894、896、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2106、2108、2364、2366、2368、2370和2372；(b)与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因编码如下任一所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、254、518、606、798、893、1090、1116、2105、2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、248、250、252、256、258、260、514、516、520、522、602、604、608、610、794、796、800、802、889、891、895、897、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1683、1685、1687、1689、1691、1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、2101、2103、2107、2109、2365、2367、2369、2371和2373；以及(c)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少85％序列同一性的多核苷酸；其中有害生物接触所述多核苷酸抑制与所述多核苷酸基本互补的所述有害生物的多核苷酸表达。...

【技术特征摘要】
2006.09.15 IB PCT/IB2006/003446;2005.09.16 US 60/71. 经分离的双链RNA分子，其包含经退火的双链，其中所述退火的链的至少一条链包 含选自以下的多核苷酸： (a) 与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因通过以下任一所 示：SEQ ID N0:ll、253、517、605、797、892、1089、1115、2104、l、3、5、7、9、13、15、17、19、21、 23、159、160、161、162、247、249、251、255、257、259、513、515、519、521、601、603、607、609、 793、 795、799、801、888、890、894、896、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、 1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1682、1684、1686、 1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2106、2108、2364、2366、 2368、 2370 和 2372 ; (b) 与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因编码如下任一所 示的氨基酸序列：SEQ ID N0:12、254、518、606、798、893、1090、1116、2105、2、4、6、8、10、 14、16、18、20、22、24、248、250、252、256、258、260、514、516、520、522、602、604、608、610、 794、 796、800、802、889、891、895、897、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、 1092、 1094、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·拉马克斯，P·菲尔德曼，G·普莱廷克，I·诺仁，E·范布勒，F·佩克尔，L·库布勒，N·达默，L·德拉格夫，I·雷莫里，T·博盖尔特，
申请(专利权)人：德福根有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE