CDKL1基因及其siRNA和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分离的CDKL1基因小分子干扰核糖核酸的标靶DNA，其中所述标靶DNA是序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一条所示的DNA，还公开了一种抑制CDKL1基因表达的小分子干扰核糖核酸和编码该siRNA的重组载体以及CDKL1基因沉默的细胞系及其应用。本发明专利技术提供的siRNA序列既能够特异性抑制CDKL1基因的表达，又可用于制备或筛选抗癌症的药物。本发明专利技术所得siRNA对研究CDKL1基因对肿瘤原发性耐药性、肿瘤增殖和迁移的影响机制以及恶性肿瘤的临床非手术治疗具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
CDKL1基因及其siRNA和应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种CDKL1基因的小分子干扰核糖核酸标靶 DNA，抑制⑶KL1基因表达的siRNA的核苷酸序列、编码所述siRNA的重组载体及其在制备 和筛选抗癌的药物中的用途。
技术介绍
胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤，占消化系统恶性肿瘤的第五位，早期胆 囊癌无特异性的临床表现，大多数患者发现时已处于进展期，进展期胆囊癌手术后的预后 很差，5年存活率仅为5%。导致胆囊癌患者术后生存期短的主要原因在于术后的复发和转 移。目前临床上没有可以用于判断胆囊癌患者术后转移的分子靶标，也没有可以用于治疗 肿瘤细胞转移的潜在的靶向药物治疗靶点。 CDKL1 (cyclin-dependentkinase-likel(CDC2_relatedkinase))是细胞周期 蛋白依赖性激酶样蛋白1。该蛋白最早在1992年被报道，Meyerson等设计了针对cdc2 蛋白的保守序列的简并引物，通过PCR的方法，从cDNA文库中鉴定出7个新的cdc2相 关激酶（cdc2relatedkinase)。其中一个被称为KKIALRE的分子后来被命名为CDKL1(M Meyerson,GHEnders，CLWu,LKSu，CGorka，CNelson,EHarlow,LHTsai:Afamilyof humancdc2_relatedproteinkinases.EMB0J1992, 11:2909-17)。 关于⑶KL1分子的功能，目前了解地非常少。已有报道Cdc2在细胞周期中，调控 细胞进入S期（MPacek，TAProkhorova,JCWalter:Cdkl:unsungheroofSphase?Cell Cycle2004, 3:401-3)，尽管和cdc2的结构具有较高的相似性，但是到目前为止CDKL1是否 参与细胞周期调控仍然未知。通过对CDKL1结构的分析，CDKL1含有一个保守的MAP激酶 双憐酸化结构域（MAPkinasedualphosphorylationmotif)。该分子可以被表皮生长因 子（epidermalgrowthfactor,EGF)激活且整个过程不需要磷酸化。另外，通过对于脑内 CDKL1的免疫组化实验研究，发现该分子主要是一个分布在胶质内的蛋白，它的主要功能可 能是影响胶质细胞生成（SHYen,AKenessey，SCLee,DWDickson:Thedistributionand biochemicalpropertiesofaCdc2-relatedkinase,KKIALRE,innormalandAlzheimer brains.JNeurocheml995, 65:2577-84)。 RNA干扰现象（RNAinterference,RNAi)是细胞内自主产生的生物进化过程中一 项保守的防御机制。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物，已成为一种通过抑制目的基因 的表达来研究哺乳动物基因功能的有效工具。直接转染合成的siRNA能特异性抑制动物细 胞内同源基因的表达，但是细胞内siRNA很容易降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干 扰。慢病毒载体在动物细胞内感染效率高，免疫原性低，且既能感染分裂期的细胞又能感染 非分裂期的细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类动物细胞内长 期稳定地表达siRNA，抑制基因表达，因此该方法具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的 特定，已成为RNA干扰技术的主要研究工具。RNA干扰技术在生物医药上的应用为临床肿瘤 的应用基础研究增加了强有力的手段。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对目前临床上肿瘤病人的预后很差，手术 后生存期很短，同时缺乏有效的预测肿瘤原发耐药的分子诊断标记物和治疗肿瘤原发耐药 的分子靶点的问题，提供一种有效抑制CDKL1基因表达的siRNA分子，所述siRNA分子作用 的标靶DNA及其在制备或筛选抗肿瘤药物中的应用。 本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案之一是：一种分离的CDKL1基因小分子 干扰核糖核酸标靶DNA，其中所述标靶DNA是： (1)⑶KL1编码基因上的连续15?27个核苷酸组成的DNA; (2)序列如SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3 和SEQIDN0:4 中任意一条 所示的DNA;或 (3)与（1)或（2)所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者 与其互补的DNA。 本专利技术所述分尚的⑶KL1基因小分子干扰核糖核酸标祀DNA分子，较佳地由⑶KL1 基因编码区上的连续10?30个核苷酸构成，更佳地为15?27个核苷酸组成的DNA;最佳 地是如序列表中SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4中任意一条所示 的DNA分子。 本专利技术所述DNA为本领域常规的DNA，其制备方法较佳地为：从天然存在的核酸序 列中提取或通过人工合成得到该DNA分子。 其中所述杂交条件根据测量杂交时所用条件的严紧性程度来分类。严紧性程度 可以核酸结合复合物或探针的解链温度Tm为依据，或者以杂交液的盐或离子强度条件为 依据。所述杂交较佳地在标准条件下进行，可根据分子克隆中描述的方式进行：Cold SpringHarborLaboratoryPress，分子生物学中的通用方案（CurrentProtocolsin MolecularBiology)。所述多聚核苷酸杂交更佳地可以按照如下步骤进行，将一个载有被 转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的 组成为〇.lwt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、加入1/20的稀释抑制剂以及2?8XSSC。20XSSC 为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50?70°C。在培养几个小时或过 夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度较佳地为室温，优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成 较佳地为6XSSC+0. 1%SDS(wt)溶液，优选为5XSSC+0. 1%SDS(wt)。当用这种清洗缓冲液 将膜清洗后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分 子。 本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案之二是：本专利技术所述标靶DNA在筛选抗 肿瘤药物中的应用。 其中所述肿瘤为本领域常规肿瘤，较佳地为胆囊癌。其中所述的应用较佳地为，本 专利技术所述标靶DNA在筛选抗癌药物的药物靶点中的用途。 其中所述药物靶点是本领域常规药物靶点，所述药物靶点是指药物在体内的作用 结合位点。合理化药物设计（rationaldrugdesign)可以依据生命科学研究中所揭示的 包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶位，或其内源性配体以及天然底物的化 学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药。通过药物靶点的选择和利 用，可以提高筛选抗肿瘤药物的效率，缩短抗肿瘤药物研究的周期。 本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案之三是：一种重组载体，其中所述重组 载体包含如上所述的标靶DNA或包含序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的CDKL1基因小分子干扰核糖核酸标靶DNA，其特征在于，所述CDKL1基因小分子干扰核糖核酸标靶DNA是：（1）CDKL1编码基因上的连续15～27个核苷酸组成的DNA；（2）序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一条所示的DNA；或（3）与（1）或（2）所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者与其互补的DNA。

【技术特征摘要】
1. 一种分离的CDKL1基因小分子干扰核糖核酸标靶DNA，其特征在于，所述CDKL1基因 小分子干扰核糖核酸标靶DNA是： (1) ⑶KL1编码基因上的连续15?27个核苷酸组成的DNA ; (2) 序列如 SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 中任意一条所示 的DNA ;或 (3) 与（1)或（2)所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者与其 互补的DNA。2. 权利要求1所述的CDKL1基因小分子干扰核糖核酸标靶DNA在筛选抗癌症的药物中 的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症为胆囊癌。4. 一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的CDKL1基因小 分子干扰核糖核酸标靶〇嫩或包含如序列表中3￡〇10勵:5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖斌，谈竹君，李茂岚，吴向嵩，翁昊，束翌俊，包润发，丁倩，曹阳，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：上海;31