一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够用于发酵生产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌，其保藏号CGMCCNo.9638。本发明专利技术还公开了苜蓿中华根瘤菌发酵生产维生素B12的生产和制备方法，包括菌株的发酵培养条件以及发酵液中维生素B12的提取方法。将固体培养基上的菌株接种到三角瓶中作为种子液，以10%的接种量接种到发酵培养基中30℃，200rpm发酵培养200h后收集发酵液，添加转化剂转化为氰基钴胺素。维生素B12作为调节机体生长过程中特殊的因子，被广泛应用在饲料、添加剂、医药、化妆品等行业，要求量逐年上升。由于菌株发酵过程易于控制，不受季节等因素的影响，原材料要求简单，发酵生产发展为主要的生产方式。

【技术实现步骤摘要】
一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用
本专利技术属于生物资源、微生物发酵和大分子天然产物生物合成
涉及一株生产维生素B12的菌株，苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobiummedicae），以及利用该菌株发酵制备维生素B12的方法，更具体的说是一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用。
技术介绍
维生素B12又叫钴胺素（Cobalamin），属于咕啉类化合物，是目前唯一一个含有金属离子的维生素类化合物，从维生素B12的结构可以看出，其基本结构包括咕啉环和配基。中心咕啉环由相连的4个吡咯和1个钴原子组成，钴螯合在4个吡咯中心。咕啉环上方的配基种类不同，构成不同类型的钴胺素，一般可以构成四个类型：（1）当配基为氰基时形成氰基钴胺素（Cyanocobalamin）；（2）当配基为羟基时形成羟基钴胺素（Hydroxocobalamin）；（3）当配基为脱氧腺苷时形成脱氧腺苷钴胺素（Adenosylcobalamin）；（4）当配基为甲基时形成甲基钴胺素（Methylcobalamin）。一般药品中钴胺素的存在形式为氰基钴胺素，但是，在体内能够发挥作用的钴胺素为腺苷钴胺素，氰基钴胺素需要转化为腺苷钴胺素之后才能发挥治疗作用。因此，对于一些较严重的患者，需要直接注射避光保存的腺苷钴胺素达到快速治疗的效果。维生素B12合成方法包括人工合成法和微生物发酵法，人工合成过程中存在着不可逾越的问题，因此，科学家们又开始探索维生素B12在微生物体内的合成过程，来解决维生素B12的生产问题。生产菌株主要有厌氧发酵菌株费氏丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌等，好氧发酵菌株脱氮假单胞菌、沼泽红假单胞菌、粗糙诺卡氏菌等。微生物合成维生素B12有两条途径：一种是好氧途径；另一种是厌氧途径。好氧途径首先合成咕啉环，然后将钴原子螯合到环内；而厌氧途径是将钴原子螯合到卟啉环中后，再结合其他原子形成含有钴原子的咕啉环。其它合成过程中，厌氧途径和好氧途径相同，只是每种途径催化的酶不同。微生物法、比色测定法、间接测定法、高效毛细管电泳法、薄层层析法和高效液相色谱法检测发酵液中B12的含量。但微生物法检测耗时长，灵敏度低，不利于发酵过程中检测；比色法仅适于分析药品等成分比较简单的样品，但对于发酵或者成分复杂的样品存在干扰作用；间接法通过钴含量的变化推算维生素B12的含量，虽然检测方法准确快速，但是样品本身含有钴，因而会造成很大误差；高效毛细管电泳法由于检测限低，会导致食品等含有微量维生素B12的检测有局限性；薄层层析法由于上样量不能统一，所以在定量检测中具有局限性；高效液相色谱法可以检测含量较低，成分复杂的样品中维生素B12的含量，具有简便、快速、准确的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有资源的不足，一方面提供一株土壤中分离得到苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCCNo.9638。本专利技术的另一个方面是提供一种维生素B12的生物合成制备方法，通过利用苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCCNo.9638，液体长时间发酵而制备维生素B12。为实现上述目的本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，从土壤中分离得到，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.9638，其详细的
技术实现思路
如下：（1）本申请人于2013年6月在天津市三叶草种植土样中分离、筛选到一株高效的菌株TIB.SM.2013。经过形态观察，生理生化试验和16SrDNA鉴定，属于苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）。申请人于2014年9月4日将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.9638。保藏日期：2014年9月4日；单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。（2）苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013的细菌学特征及生理生化指标：①该苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013保藏号CGMCCNo.9638。在蔗糖琼脂培养基上生长较慢，于30℃有氧条件下生长5天，菌落直径为3-5mm，呈为红褐色，椭圆，菌落光滑；菌落形态特征参见图1。该菌株呈短杆状，中间具有颗粒，长3-8μm，无孢子。②本专利技术所提供的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013，保藏号CGMCCNo.9638。G+Cmol的%含量为63.20%，该菌株的适宜生长温度是28-30℃，液体长时间发酵时可以生物合成维生素B12。本专利技术进一步公开了苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，保藏号CGMCCNo.9638，在制备生物合成维生素B12方面的应用。其在发酵液中产生维生素B12的浓度至少为50mg/L。本专利技术所述的苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，其基因组DNA的G+Cmol的%含量为63.20%；其中G：C的摩尔比为1：2.3。本专利技术更进一步公开了一种组合物，它包括苜蓿中华根瘤菌发酵液、苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，保藏号CGMCCNo.9638，组合物包括：维生素B12、玉米浆、蔗糖、DMB、S-腺苷甲硫氨酸等。本专利技术同时也公开了苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，保藏号CGMCCNo.9638生产维生素B12的培养和提取方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）将苜蓿中华根瘤菌株斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中，在28-32℃，150-220rpm摇床振荡条件下，培养36h，制备种子液；（2）将种子液按5-20%的接种量（V/V）接种至发酵培养基，然后在25-30℃培养6-9天，得到苜蓿中华根瘤菌发酵液；（3）在步骤（2）获得的发酵液中添加8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸1:1（V/V），沸水浴20-30min释放菌体中的产物并转化为氰基钴胺素，10000-12000rpm离心10min收集上清液分离检测产物所述培养基按重量由以下组分组成：6-40份的碳源、5-30份的有机氮源、0.5-10份的无机盐，加水至1000份，调节pH=6.8-7.0。所述碳源为蔗糖、麦芽糖、乳糖或甜菜碱。所述有机氮源为玉米浆、酵母抽提物、酵母浸粉、酵母浸膏、酵母粉、酵母自溶粉或玉米浆粉。所述无机盐是由下述重量份数的原料组成：七水硫酸镁MgSO40.1-2g/L、磷酸氢二钾0.5-3g/L、硫酸锌0.2-1g/L、硫酸锰0.1-3g/L、氯化钴0.3-5g/L、5、6—二甲基苯并咪唑0.01-2g/L。本专利技术更加详细的描述如下：一种维生素B12的制备方法，包括：(a)在液体培养基中培养苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013；和（b）将培养的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013在其生长期内接种至发酵培养基，由此通过苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013使发酵培养基发酵。优选地，苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013获自琼脂固体培养基菌种。还优选地，培养的苜蓿中华根瘤菌TIB.SM.2013按5-15%的接种量（V/V）接种至发酵培养基。进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobium medicae）TIB.SM.2013，从土壤中分离得到，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 9638。

【技术特征摘要】
1.一种苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013，从土壤中分离得到，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.9638。2.权利要求1所述苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013在用于生物合成维生素B12方面的应用；其在发酵液中产生维生素B12的浓度至少为50mg/L。3.一种采用权利要求1所述苜蓿中华根瘤菌株（Sinorhizobiummedicae）TIB.SM.2013生产维生素B12的培养和制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）将苜蓿中华根瘤菌株斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中，在28-32℃，150-220rpm摇床振荡条件下，培养36h，制备种子液；（2）将种子液按5-20%的接种量（V/V）接种至液体发酵培养基，然后在25-30℃培养6-9天，得到苜蓿中华根瘤菌发酵液；（3）在步骤（2）获得的发酵液中添加8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸1:1（V/V），沸水浴20-30min释放菌体中的产物并转化为氰基钴胺素，1000...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，李莎，夏苗苗，房欢，周文娟，郑平，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12