本发明专利技术提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，包括牛乳血清白蛋白特异肽、同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标，以及蛋白酶解试剂和质控样品。牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LVNELTEFAK；同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LV*NEL*TEFAK；同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为：QCPFDEHVKLV*NEL*TEFAKTCVADESHAGC，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。本发明专利技术试剂盒用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够准确对各类含乳样品中的牛乳血清白蛋白进行定量检测，保证了结果的可靠性，且所使用的试剂用量少，检测成本低。
【技术实现步骤摘要】
一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒
本专利技术涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳血清 白蛋白定量的检测试剂盒。
技术介绍
牛血清白蛋白（Bovineserumalbuminn，BSA)是牛血清中的一种主要的球蛋白之 一，也是乳清蛋白的成分之一，又称第五组分（FractionV)，简称为BSA，包含583个氨基酸 残基，分子量为66. 43kDa，25°C下水中等电点为4. 7,主要存在于牛血清中，约占牛血清中 总蛋白的52-62% ;此外，在牛奶中也含有少量的血清白蛋白，约为牛奶中总蛋白的1. 4%。 据报道，牛血清白蛋白最主要的生理作用为维持人体血液中的渗透压和PH值平 衡，而Karjalainen(1992)等人则发现婴幼儿从牛奶中摄入的牛血清白蛋白与胰岛素依赖 性糖尿病（IDDM)的引发有直接的关系，其研究表明，在母乳哺喂六个月后再喂含一定量牛 血清白蛋白的乳制品可大大减少婴儿引发胰岛素依赖性糖尿病的可能性。因此，研究乳及 乳制品中牛血清白蛋白的量对婴幼儿的健康成长有着重要的作用。 目前国内外用于牛乳血清白蛋白检测最主要的方法为ELISA法，该法灵敏度高、 特异性强，但对操作人员要求高，重现性较差，定量结果不准确，可满足样品的初筛，而准确 定量尚有缺陷。经查询，至今为止还未发现应用同位素内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS 测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳血清白蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法， 结合LC-ESI-MS/MS可定量测定不同乳及乳制品中牛乳血清白蛋白含量的试剂盒。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法， 结合LC-ESI-MS/MS定量检测牛乳血清白蛋白的方法。 为了解决上述第一个技术问题，本专利技术提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂 盒，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素 标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK(SEQ IDNO. 1);所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV*NEL*TEFAK(SEQID NO. 2,其中同位素标记*符号未显示)，其中V#和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同 位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV#NEL#TEFAKTCVADESHAGC(SEQ IDNO. 3,其中同位素标记符号*未显示出），其中，和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸。 作为一个优选方案，所述试剂盒还包括氯化钙（CaCl2),碳酸氢铵（NH4HCO3)，二硫 苏糖醇（DTT)，碘代乙酰胺（IAA)，胰蛋白酶和甲酸。 作为一个优选方案，所述氯化钙的使用浓度是100mmol/L，碳酸氢铵的使用溶度是 50mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰 蛋白酶的使用浓度是200iig/mL。 为了解决上述第二个技术问题，本专利技术提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测方 法，包括以下步骤： (1)样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血 清白蛋白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和 胰蛋白酶溶液，37°c恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过 0. 22ym微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳铁蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHV KLV#NEL#TEFAKTCVADESHAGC，其中V#和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸； (2)步骤（1)所得样品进行液相色谱分离； (3)样品经步骤（2)色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽 的氨基酸序列为LVNELTEFAK;所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为 LV#NEL#TEFAK，其中V#和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸。 作为一个优选方案，步骤（1)中加入的胰蛋白酶的量与样品中蛋白质的量比例为 1:50-1:100。 作为一个优选方案，步骤（1)中碳酸氢铵溶液的溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇 溶液的浓度是500mm〇I/L，碘代乙酰胺溶液的浓度是500mmoI/L，氯化钙溶液的浓度是 100mm〇l/L，胰蛋白酶溶液的浓度是200iig/mL。 作为一个优选方案，步骤（2)液相色谱分离条件如下：C18 (孔径300A)色谱柱； 柱温为40°C，流动相A为0. 1% (v/v)的甲酸水溶液，流动相B为含0. 1% (v/v)甲酸的乙腈 溶液，梯度洗脱，流速为〇. 3mL/min。 作为一个优选方案，步骤（3)质谱检测条件如下：毛细管电压3. 5kv，锥孔电压 35kv，脱溶剂温度500°C，脱溶剂气流量900L/min，锥孔反吹气流量30L/hr，碰撞室压力 3.OX10_3mbar;低端分辨率I:2. 5V，高端分辨率I:15. 0V，离子能量1 5 ;低端分辨率2 : 2.8￥，高端分辨率2:15.(^，离子能量2:1.0 ;离子源温度1501：，提取器电压3.(^，入口透 镜电压0. 5V，出口电压0. 5V，碰撞梯度I. 0 ;所述牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷 形式，其质荷比为582. 9m/z，它的两个特征碎片离子分别为365. 4m/z和213. 2m/z，对应的 碰撞能量分别为21eV和17eV;所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷 形式，其质荷比为589. 2m/z，它的两个特征碎片离子分别为365. 3m/z和219.lm/z，对应的 碰撞能量分别为22eV和16eV。 本专利技术的优点在于，（1)本专利技术所开发的试剂盒使用经研究设计合成的同位素标 记内标物，能够准确的对牛乳、配方粉以及天然原料等各类样品中的牛乳血清白蛋白进行 定量检测，保证了结果的可靠性；（2)先进可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质 量和检测结果的重现性，可满足大批量样品检测的需求；（3)本专利技术试剂盒配制齐全，可简 便地完成试剂配制，且易在一般实验室推广应用；（4)本专利技术可用于同时检测样品中非变 性和热变性的牛乳血清白蛋白；（5)本专利技术所使用的试剂用量少，检测成本低。 【附图说明】 图1为本专利技术试剂盒所涉及的核心试剂整体外观照片。 图2为本专利技术中所选牛乳血清白蛋白特异肽在牛乳血清白蛋白一级结构中的位 置。 图3为本专利技术中的牛乳血清白蛋白特异肽色谱分离图（a)和质谱鉴别图（b)。 图4为本专利技术中的同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的色谱分离图（a)和质谱鉴 别图（b)。 图5为本专利技术中的同位素标记牛乳血清白蛋白内标的色谱分离图（a)和质谱鉴别 图（b)。 图6为本专利技术中的同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽与牛乳血清白蛋白特异肽 的线性比较图。 图7为本专利技术中同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽与牛乳血清白蛋白特异肽在 不同基质中的基质效应比较图。 图8为本专利技术中的同位素标记牛乳血清白蛋白内标与牛本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV*NEL*TEFAK，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV*NEL*TEFAKTCVADESHAGC，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。
【技术特征摘要】
1. 一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋 白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛 乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK ;所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异 肽的氨基酸序列为LV#NEL#TEFAK，其中，和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素 标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV#NEL#TEFAKTCVADESHAGC，其中V #和 C为碳氮全同位素标记的氨基酸。2. 根据权利要求1所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒还包括氯化钙，碳酸氢铵，二硫苏糖醇，碘代乙酰胺，胰蛋白酶和甲酸。3. 根据权利要求2所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述氯 化钙的使用浓度是100mm〇l/L，碳酸氢铵的使用溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度 是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用浓度是200 ii g/mL。4. 一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血清白蛋 白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和胰蛋白 酶溶液，37°C恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过0. 22 y m 微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLf NEI/TEFAKTCVADESHAGC，其中V#和I；为碳氮全同位素标记的氨基酸； (2) 步骤（1)所得样品进行液相色谱分离； (3) 样品经步骤（2)色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸 序列为LVNELTEFAK ;所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为L(V#)NE(L， TEFAK，其中V#和I；为碳氮...
【专利技术属性】
技术研发人员：任一平，赖世云，张京顺，
申请(专利权)人：上海科倍斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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