本发明专利技术属于生物医学领域，公开了一种体外获得调节性巨噬细胞的方法。涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种新的调节性巨噬细胞的方法。具体而言，本发明专利技术所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，表达巨噬细胞表面分子标志，以高表达CD45RB，中等表达CD11c为特征，并且该细胞具有类似于M2b性巨噬细胞的细胞因子表达谱。依赖于与ESSC接触培养，该巨噬细胞能够分泌高水平IL-10，并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡，说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。该方法为体外大量诱导获得高分泌IL-10的巨噬细胞提供了新的方法，可以应用于实验和临床。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物医学领域，公开了一种体外获得调节性巨噬细胞的方法。涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种新的调节性巨噬细胞的方法。具体而言，本专利技术所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，表达巨噬细胞表面分子标志，以高表达CD45RB，中等表达CD11c为特征，并且该细胞具有类似于M2b性巨噬细胞的细胞因子表达谱。依赖于与ESSC接触培养，该巨噬细胞能够分泌高水平IL-10，并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡，说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。该方法为体外大量诱导获得高分泌IL-10的巨噬细胞提供了新的方法，可以应用于实验和临床。【专利说明】
本专利技术属于生物医学领域，涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种调节性巨噬细胞的方法。具体而言，本专利技术所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，表达巨噬细胞表面分子标志，以高表达⑶45RB，中等表达⑶Ilc为特征。该巨噬细胞能够分泌高水平IL-10，并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡，说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。
技术介绍
巨噬细胞是一类多功能的固有免疫细胞，分布于体内的各个器官、结缔组织、浆膜腔等。根据巨噬细胞的功能，可将其分为Ml型巨噬细胞(或称为经典活化的巨噬细胞)和M2型巨卩遼细胞(或旁路活化巨卩遼细胞)。Ml型巨噬细胞易受促炎信号刺激，比如Toll样受体配体和Thl细胞因子；M2型巨噬细胞主要由抗炎介质诱导，包括IL-10，TGF-β，糖皮质激素，免疫复合物，凋亡细胞等。Ml型巨噬细胞主要在清除微生物、介导Thl免疫应答反应上发挥重要作用，M2型巨曬细胞主要参与Th2相关的免疫应答反应，并且发挥免疫调节作用。近些年，根据M2型巨噬细胞的基因表达和趋化因子进一步将其分为M2a，M2b，和M2c巨噬细胞。Th2型细胞因子IL-4和(或)IL-1 3可诱导巨噬细胞向M2a巨噬细胞分化，M2a巨噬细胞上调甘露醇受体的表达，分泌细胞外基质，也与某些寄生虫病相关；糖皮质激素、IL-1 O, TGF-β等抗炎刺激可刺激巨噬细胞分化为 M2c 巨曬细胞。 巨噬细胞在Toll样受体的配体或IL-1R激动剂存在的情况下受到免疫复合物的刺激会形成M2b巨噬细胞，也有研究表明清除凋亡的中性粒细胞过程也会形成M2b巨噬细胞。这类巨噬细胞主要特征是分泌大量的IL-10，IL-6和TNF-α，几乎不分泌IL-12，一般把分泌IL-1O与IL-12的差距作为鉴定M2b巨噬细胞的一个指标。越来越多的研究表明M2b巨噬细胞在免疫调节和Th2细胞分化方面发挥作用，所以也被称为“调节性巨噬细胞” 。但是这些不同亚型的巨噬细胞所表达的特异性表面标志还没有一个确切的定论，因为巨噬细胞的生物特征具有很大可塑性，不同微环境可明显改变其生物学功能，并分化为不同功能亚群。目前基质细胞常被作模拟体内微环境，大部分基质细胞由间充质来源的细胞组成，如成纤维细胞、内皮细胞等等，可以诱导定向造血干细胞的分化。脾脏是一个重要的二级淋巴器官，研究已经证明脾基质细胞可以诱导骨髓中的DC或DC前体的增殖和分化，也可诱导造血干细胞和成熟DC分化为调节性DC。然而脾脏基质细胞是否能够诱导调节性巨噬细胞的产生还不清 λ.Μ /E.ο
技术实现思路
本专利技术公开了一种新的调节性巨噬细胞的诱导方法。该方法使用脾脏基质细胞诱导骨髓单个核细胞分化成为调节性巨噬细胞。该细胞具有高水平IL-1O分泌和T细胞增殖抑制等特性。并且，该细胞有自己独特的细胞因子表达谱。 本专利技术通过上述的脾脏基质细胞与骨髓单个核细胞共培养，获得新型的调节性巨噬细胞，并对其表型进行鉴定。具体包括以下步骤: I)内皮样脾基质细胞(ESSC)的获得和鉴定。 无菌分离I周龄C57BL/6J小鼠脾脏，用无菌剪刀剪至l_2mm大小的组织快，将其均匀地、牢固地贴于6孔板底部，随后加入20% RPM1-1640，所加入的液体量应少许，这样可使组织块不易脱落，次日再补20% RPM1-1640 Iml/孔，放入CO2细胞培养箱，待孔底细胞饱和度达到80% -90%时，开始传代。刚开始仍用20% RPM1-1640传代，待传代4或5次后可更换成 10% RPM1-1640。 ESSC通过形态学鉴定和表面Marker进行鉴定。形态学观察主要在光学倒置显微镜下进行。通过流式细胞术鉴定内皮细胞表面表达的特异性分子CD106来确定我们所分离出的ESSC是否为内皮型。细胞消化下来后用FACS洗液洗涤一遍，用100 μ I FACS洗液重悬，然后根据抗体说明书加Ant1-PE⑶106，而后用FACS Calibur流式细胞仪检测。 2)获取骨髓单个核细胞与ESSC共培养。 无菌分离4_6w的C57BL/6J小鼠的腿骨，用注射器冲洗并分离骨髓腔内的细胞，冲洗完毕后经过棉芯过滤，离心；而后，用含10%血清的1640培养基重悬待用。 之前将ESSC种六孔板。待ESSC饱和度达到50%时，将获取的骨髓单个核细胞以5X106/10% RPM1-1640 4ml/孔种于ESSC上培养14天，培养期间每3_4天半定量换液，弃去一半旧培养液换成等量新培养液。培养14天后收集细胞，进行后续试验。 3)共培养细胞的特征鉴定 于ESSC共培养14天后，将细胞轻轻从ESSC上吹下，部分细胞甩片后进行吉姆萨染色确定形态；其余细胞分别进行表面标志分子染色和细胞因子表达谱测定。对于表面标志分子检测，将吹下的细胞用FACS洗液重悬，重悬后的细胞分别染F4/80、⑶14、⑶40、⑶80、⑶86、la、CDllb, CDllc, CD45RB、CD4、CD8和⑶19，并进行流式检测。对于细胞因子表达谱使用ELISA的方法，吹下来的分化细胞收取后种于96孔板，I X 105/200 μ I 10%RPM1-1640/孔，用LPS I μ g/ml刺激24h收培养上清，检测细胞因子IL-6、TNF- a、ILl-β和IL-10的分泌。 4)分化的调节性巨噬细胞分泌高水平IL-10需要与ESSC直接接触。 ESSC传代到24孔板中，到50%饱和度时，分将骨髓单个核细胞于ESSC混合培养和分离培养。混合培养的情况下，可直接种骨髓单个核细胞到ESSC细胞上；分隔培养使用Transwell板，将骨髓单个核细胞种于Tanswell孔上，孔下为ESSC。培养14天后，分别取出分化的细胞，并且对每孔取出的细胞数进行计数。计数后分别种于96孔板，一部分孔用LPS I μ g/ml刺激24h收培养上清，检测IL-10分泌。 5)调节性巨噬细胞对T细胞增殖和凋亡的影响。 无菌获取6-8周龄C57BL/6J小鼠的脾脏，用免疫磁珠的方法纯化⑶4+⑶25_T细胞。将这群细胞标记CFSE后与分化的巨噬细胞共培养，5天后收取培养上清用于检测细胞因子，收取细胞用于检测分化细胞对T细胞增殖和凋亡的影响。 【专利附图】【附图说明】 图1脾脏基质细胞形态与表面分子鉴定； 图2分化的调节性巨噬细胞形本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新的诱导调节性巨噬细胞的方法，其特征在于，所述分选材料包括脾脏基质细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆阳，张纪岩，王小茜，肖鹤，张雪莹，黎燕，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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