生产型细胞系的增强子制造技术

本发明专利技术涉及在生产型细胞中异位表达EDEM2从而改善有用的多亚基蛋白质的产率的发现。因此，本发明专利技术提供了包含编码EDEM2的重组多核苷酸的生产型细胞系，例如经典的哺乳动物生物制药生产型细胞—CHO细胞。此外，本发明专利技术还公开了包含EDEM2的编码多核苷酸以及XBP1的编码多核苷酸的生产型细胞。也公开由这些细胞系生产的抗体的改善效价以及培养中由这些细胞得到的改善的细胞密度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产型细胞系的增强子 相关申请的交叉引用 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2012年5月29日提交的美国临时专利申请 号61/652, 549的权益，该申请的全部内容明确地以引用方式并入本文。
本申请涉及一种或多种细胞，其表达用于改善地生产多亚基蛋白质的重组应激反 应凝集素。具体而言，本专利技术提供了包含编码EDEM2的基因的哺乳动物细胞及由其衍生的 细胞系，并且其产生高效价的抗体。
技术介绍
制造治疗活性的蛋白质需要在分泌之前进行适当的折叠和加工。适当的折叠与蛋 白质（例如抗体）尤其相关，所述的蛋白质由多个亚基组成，这些亚基在分泌之前必须适当 地组装。真核细胞适应这样的系统，该系统确保蛋白质适当地折叠，并除去分泌途径中错误 折叠的蛋白质。该系统被称为未折叠蛋白质反应（UPR)途径，并且由错误折叠的蛋白质在 内质网（ER)中的累积所引发。 UPR的早期事件是转录因子Xbpl的激活，其依次激活内质网降解增强α -甘露糖 苷酶-样蛋白质2(EDEM2)的转录，而该内质网降解增强α-甘露糖苷酶-样蛋白质2为内 质网相关性降解（ERAD)途径的成员。EDEM2促进了错误折叠蛋白质的去除。ERAD途径包 含5个步骤：（1)分子伴侣介导的对畸形蛋白质的识别；（2)使畸形蛋白质靶向与EDEM2有 关的逆向转运机制或Ε3连接酶；（3)逆向转运的引发；（4)泛素化及进一步逆向转运；以及 (5) 蛋白体靶向及降解。 抗体为包含两条重链和两条轻链的多亚基蛋白质，其必须适当地折叠并结合从而 形成功能异四聚体。为了改善功能抗体异四聚体的产率或效价，对重链和轻链的高效和精 确加工的任何改良以都是需要的。 专利技术概述 本 申请人:惊奇地发现，在制造蛋白质的细胞系中，EDBC的异位表达增加蛋白质的 平均产量/细胞，增加被分泌至培养基中的蛋白质的效价，并增加生产型细胞系的积分细 胞密度。 因此，在一个方面中，本专利技术提供了细胞，其包含（a)编码应激诱导的甘露糖结合 凝集素的重组多核苷酸和（b)编码多亚基蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，应激诱 导的甘露糖结合凝集素为EDEM2蛋白质，其非限定性的实例在表1中提供，并且多亚基蛋白 质为抗体。在其他的实施方案中，所述的细胞还包含编码活性剪切形式的XBPl的多核苷 酸，其非限定性的实例在表2中提供。在一个实施方案中，所述的细胞为哺乳动物细胞，例 如在生物制药制造中使用的CHO细胞。 在另一个方面中，本专利技术提供了由在上一方面中所述的细胞衍生的细胞系。 由……衍生的意思是指由单个细胞以克隆方式遗传并具有一些所选的品质的细胞群体， 例如生产给定效价的活性蛋白质的能力或增殖至特定密度的能力。在一些实施方案中，所 述的细胞系能够生产效价为至少3克/升培养基（g/L)、至少5g/L或至少8g/L的多亚基蛋 白质，其中所述的细胞系衍生自容留编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和 编码多亚基蛋白质的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，与由基本相同的细胞衍生的但 不具有编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系所获得的积分细胞密 度相比，所述的细胞系可以获得高至少30%、至少50%、至少60%或者至少90%的积分细 胞密度（ICD)。 在另一个方面中，本专利技术提供了包含编码EDBC蛋白质的核酸序列的分离的或重 组的多核苷酸，所述的多核苷酸与构成型且普遍表达的哺乳动物启动子（例如泛素 C启动 子）可操作地连接（顺式）。在一些实施方案中，EDEM2蛋白质具有SEQ ID NO:8的氨基 酸，或者与SEQ ID NO: 1-7的任意一个具有至少92%-致性的氨基酸序列。在一些实施方 案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO: 16的核酸序列。在一个具体的实施方案中，所述的 多核苷酸由SEQ ID N0:14的核酸序列组成；在另一个具体的实施方案中，所述的多核苷酸 由SEQ ID NO: 15的核酸序列组成。 在另一个方面中，本专利技术提供了包含编码XBPl蛋白质的核酸序列的分离的或重 组的多核苷酸，所述的多核苷酸与构成型且普遍表达的哺乳动物启动子（例如泛素 C启动 子）可操作地连接（顺式）。在一些实施方案中，XBPl蛋白质具有SEQ ID NO: 13的氨基酸， 或者与SEQ ID N0:9-12的任意一个具有至少86%-致性的氨基酸序列。在一些实施方案 中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO: 18的核酸序列。在一个具体的实施方案中，所述的多 核苷酸由SEQ ID NO: 17的核酸序列组成。 在另一个方面中，本专利技术提供了一种细胞，其包含在上一方面中所述的EDHM2的 编码多核苷酸和编码多亚基蛋白质（例如抗体）的多核苷酸。在一些实施方案中，所述的 细胞还包含在上一方面所述的XBPl的编码多核苷酸。在一个实施方案中，多亚基蛋白质为 抗体，抗体的重链包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的氨基酸序列，抗体的轻链包含SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:46的氨基酸序列。在这种及多个实施方案中，多亚基蛋白质的各个 多肽亚基由独立的多核苷酸所编码。因此，例如编码抗体的多核苷酸可以包含编码重链的 多核苷酸和编码轻链的多核苷酸，因此包含两个亚基。在一些实施方案中，所述的细胞为中 国仓鼠卵巢（CHO)细胞。 在一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID N0:20的重链可变区氨 基酸序列和SEQ ID N0:22的轻链可变区氨基酸序列的抗⑶F8抗体。在一个实施方案中， 抗⑶F8抗体包含具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸 序列的轻链。在一个实施方案中，编码抗⑶F8抗体的重链的多核苷酸包含SEQ ID N0:23 的核酸序列；并且编码抗⑶F8抗体的轻链的多核苷酸包含SEQ ID NO:25的核酸序列。在 一个实施方案中，编码抗⑶F8抗体的重链的多核苷酸由SEQ ID N0:24的核酸序列组成；并 且编码抗⑶F8抗体的轻链的多核苷酸由SEQ ID NO:25的核酸序列组成。 在另一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID N0:28的重链可变区 氨基酸序列和SEQ ID N0:30的轻链可变区氨基酸序列的抗ANG2抗体。在一个实施方案中， 抗ANG2抗体包含具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 29的氨基酸 序列的轻链。在一个实施方案中，编码抗ANG2抗体的重链的多核苷酸包含SEQ ID N0:31 的核酸序列；并且编码抗ANG2抗体的轻链的多核苷酸包含SEQ ID NO: 33的核酸序列。在 一个实施方案中，编码抗ANG2抗体的重链的多核苷酸由SEQ ID N0:32的核酸序列组成；并 且编码抗ANG2抗体的轻链的多核苷酸由SEQ ID NO: 34的核酸序列组成。 在另一个实施方案中，所编码的多亚基蛋白质为具有SEQ ID N0:36的重链可变区 氨基酸序列和SEQ ID NO: 38的轻链可变区氨基酸序列的抗ANGPTL4抗体。在一个实施方 案中，抗ANGPTL4抗体包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞，其包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和编码多亚基蛋白质的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.29 US 61/652,549;2013.05.29 US 13/904,5871. 一种细胞，其包含编码应激诱导的甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸和编码多亚基 蛋白质的多核苷酸。2. 权利要求1所述的细胞，其中所述的应激诱导的甘露糖结合凝集素为内质网降解增 强a-甘露糖苷酶-样蛋白质2(EDEM2)。3. 权利要求2所述的细胞，其中所述的EDEM2包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列。4. 权利要求2所述的细胞，其中所述的EDEM2包含与SEQ ID NO: 1具有至少92%的一 致性的氨基酸序列。5. 权利要求1-4的任意一项所述的细胞，其中所述的多亚基蛋白质为抗体。6. 权利要求5所述的细胞，其中所述的抗体包含SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID NO :45和SEQ ID NO :46的氨基酸序列。7. 权利要求1-6的任意一项所述的细胞，其包含编码未折叠蛋白质反应转录因子的多 核苷酸，其中所述的未折叠蛋白质反应转录因子在所述的EDEM2的上游进行操作。8. 权利要求7所述的细胞，其中所述的转录因子为剪切形式的XBP-1。9. 权利要求8所述的细胞，其中所述的XBP-1包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。10. 权利要求8所述的细胞，其中所述的XBP-1包含与SEQ ID N0:9具有至少86%的 一致性的氨基酸序列。11. 权利要求1-10的任意一项所述的细胞，其中所述的细胞为哺乳动物的细胞。12. 权利要求1-11的任意一项所述的细胞，其中所述的细胞为CH0细胞。13. -种由权利要求1-12的任意一项所述的细胞衍生得到的细胞系。14. 权利要求13所述的细胞系，其生产效价为至少3g/L的所述的蛋白质。15. 权利要求13或权利要求14所述的细胞系，其生产效价为至少5g/L的所述的蛋白 质。16. 权利要求13-15的任意一项所述的细胞系，其生产效价为至少8g/L的所述的蛋白 质。17. 权利要求13-16的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的 甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细 胞密度高出至少大约30%。18. 权利要求13-17的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的 甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细 胞密度高出至少大约50%。19. 权利要求13-18的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的 甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细 胞密度高出至少大约60%。20. 权利要求13-19的任意一项所述的细胞系，其中与不包含所述的编码应激诱导的 甘露糖结合凝集素的重组多核苷酸的细胞系的积分细胞密度相比，所述的细胞系的积分细 胞密度高出至少大约90%。21. -种包含编码EDEM2的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛素 C启动子 可操作地连接。22. 权利要求21所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含SEQ ID NO:8的氨基 酸序列。23. 权利要求21或权利要求22所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。24. 权利要求21-23的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含与SEQ ID NO: 1具有至少92%的一致性的氨基酸序列。25. 权利要求21-24的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由与SEQ ID NO: 1具有至少92%的一致性的氨基酸序列组成。26. 权利要求21-25的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。27. 权利要求21-26的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的EDEM2由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成。28. 权利要求21-27的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列。29. 权利要求21-28的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。30. 权利要求21-29的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的核苷酸序列组成。31. -种包含编码Xbp-1蛋白质的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛素C 启动子可操作地连接。32. 权力要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列。33. 权力要求31或权利要求32所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由 SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成。34. 权利要求31-33的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含 与SEQ ID N0:9具有至少86%的一致性的氨基酸序列。35. 权利要求31-34的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由与 SEQ ID N0:9具有至少86%的一致性的氨基酸序列组成。36. 权利要求31-35的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质包含 SEQ ID NO:9的氨基酸序列。37. 权利要求31-36的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的Xbp-1蛋白质由 SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。38. 权利要求31-37的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。39. 权利要求31-38的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。40. 权利要求31-39的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID NO: 17的核苷酸 序列组成。41. 一种包含编码抗GDF8抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物的泛 素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。42. 权利要求41所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列。43. 权利要求41或权利要求42所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。44. 权利要求41-43的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体重链 由SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成。45. 权利要求41-44的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 23的核苷酸序列。46. 权利要求41-45的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 24的核苷酸序列。47. 权利要求41-46的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID N0:24的核苷酸 序列组成。48. -种包含编码抗GDF8抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素 C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。49. 权利要求48所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链包含SEQ ID NO :22的氨基酸序列。50. 权利要求48或权利要求49所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链 包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。51. 权利要求48-50的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗GDF8抗体轻链 由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。52. 权利要求48-51的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 25的核苷酸序列。53. 权利要求48-52的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 26的核苷酸序列。54. 权利要求48-53的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID N0:26的核苷酸 序列组成。55. -种包含编码抗ANG2抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素 C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。56. 权利要求55所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列。57. 权利要求55或权利要求56所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链 包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。58. 权利要求55-57的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体重链 由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。59. 权利要求55-58的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 31的核苷酸序列。60. 权利要求55-59的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 32的核苷酸序列。61. 权利要求55-60的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID N0:32的核苷酸 序列组成。62. -种包含编码抗ANG2抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物泛素 C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。63. 权利要求62所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列。64. 权利要求62或权利要求63所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链 包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。65. 权利要求62-64的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗ANG2抗体轻链 由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。66. 权利要求62-65的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。67. 权利要求62-66的任意一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 34的核苷酸序列。68. 权利要求62-67的任意一项所述的多核苷酸，其基本上由SEQ ID N0:34的核苷酸 序列组成。69. -种包含编码抗AngPtl4抗体重链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物 泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。70. 权利要求69所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重链包含SEQ ID NO :36的氨基酸序列。71. 权利要求69或权利要求70所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重 链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。72. 权利要求69-71的任意一项所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体重 链由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成。73. 权利要求69-72的任意一项所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 39的核苷 酸序列。74. 权利要求69-73的任意一项所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID N0:40的核苷 酸序列。75. 权利要求69-74的任意一项所述的分离的多核苷酸，其基本上由SEQ ID N0:40的 核苷酸序列组成。76. -种包含编码抗AngPtl4抗体轻链的核苷酸序列的分离的多核苷酸，与哺乳动物 泛素C启动子或人CMV-IE启动子可操作地连接。77. 权利要求76所述的分离的多核苷酸，其中所述的抗AngPtl4抗体轻链包含SEQ ID NO :38的氨基酸序列。78. 权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，D·布拉科夫，D·德施潘德，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US