本发明专利技术提供用于评估膜蛋白构象稳定性的分析，包括：(a)提供包含膜蛋白的第一群体和第二群体的样本；其中在所述第一群体中的膜蛋白标记有供体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有接受体标记，或者在所述第一群体中的膜蛋白标记有接受体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有供体标记；(b)将所述膜蛋白的第一和第二群体暴露至稳定性调节剂和/或条件；(c)以及，通过激活所述供体标记以允许与所述接受体标记进行产生可检测信号的距离依赖性相互作用，来评估在所述第一和第二群体的膜蛋白之间的聚集。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析
本专利技术涉及用于评估膜蛋白稳定性，尤其是G蛋白偶联受体(GPCR)的稳定性的分析。
技术介绍
在过去20年中确定膜蛋白结构的速率逐渐增加，但大多数成功在于结晶来自细菌，而非真核生物的膜蛋白。与真核生物膜蛋白[1]相比，在大肠杆菌中使用标准技术更容易过表达细菌膜蛋白，并且细菌蛋白有时在洗涤剂中远远更加稳定，而洗涤剂稳定性是进行纯化和结晶一个必不可少的先决条件。真核生物膜蛋白除了在过表达中的困难，其往往在洗涤剂溶液中具有不良的稳定性，这严重限制了没有其直接变性或沉淀的可被探究的结晶条件的范围。理想情况下，膜蛋白应该在任何给定的洗涤剂溶液中稳定多日，但最适合于生长衍射质量的晶体的洗涤剂倾向于最去稳定的洗涤剂，即具有短脂肪链和小的头部基团或带电头部基团的那些。这也是我们想要解决的人类膜蛋白的结构，因为需要其通过制药工业来帮助发展治疗药剂。因此，有发展一种通用策略的压倒性需要，所述通用策略允许生产洗涤剂稳定的真核整合膜蛋白来进行结晶和结构确定，并可能可用于其它目的，例如药物筛选、生物分析和生物传感器的应用。GPCR组成了控制许多生理过程并且是许多有效药物靶标的一个极大的蛋白家族。因此，其在药理学上相当重要。在Foord等人(2005)PharmacolRev.57,279-288中给出GPCR的列表，通过引用并入本文。GPCR被分离时通常是不稳定的；并且虽然通过相当大的努力，却很少有晶体结构存在。GPCR是药物靶标，特别参照Overington等人(2006)NatureRev.DrugDiscovery5,993-996，其指出现有药物中超过四分之一以GPCR作为靶标。GPCR被认为以多种不同构象存在，所述构象与配体的不同药理学种类，如激动剂和拮抗剂相关，并且在这些构象之间循环以行使功能(KenakinT.(1997)AnnNYAcadSci812,116-125)。我们已经认识到，存在与试图结晶GPCR相关联的两个严重问题，即其缺乏稳定性(例如，在洗涤剂中)，并且其存在于多种构象中的事实。为了行使功能，GPCR已经进化为在至少两种不同构象(激动剂结合型和拮抗剂结合型)中循环，并且在这两种构象之间的变化可以在没有配体时自发地发生。因此，有可能任何纯化的受体构成了构象混合物。在结晶试验中只是将配体加至GPCR并没有导致其结构的确定。我们发现，通过组合对整个受体进行系统诱变扫描以及基于配体结合的热稳定分析，可以生成稳定的受体(StaR)。StaR生成的方法导致受体的特定构象的稳定。该方法的详细描述可以在别处[2，3，4]以及在WO2008/114020和WO2009/071914中找到。简要地，为了稳定特定构象的受体，将溶解的受体与过量的激动剂或拮抗剂一起温育，这取决于所期望的构象。然后，将受体/配体复合物在不同温度下加热一定长度的时间。加热之后，从受体/配体复合物分离多余的未结合的配体。在任何给定温度下配体结合的百分比用作加热之后余下折叠受体量的示值读数。相对温度绘制这些数据产生热衰减曲线，Tm值被定义为在保持50％受体活性的温度。这个方法有赖于可获得具有高亲和性的良好配体和在洗涤剂中的有利性质。然而，在某些情况下这样的配体不可得，因此非常需要一种分析，其不需要配体，即其中不用配体结合活性测量受体活性。历史上，通过各种分析技术研究了蛋白质在加热过程中的结构变化，所述分析技术例如沉淀速度、差示扫描量热法、动态光散射法、圆二色光谱、UV/VIS光谱法、电泳、荧光和NMR。然而，这些技术通常需要大量的蛋白质，难以适应高通量筛选，并因为来自洗涤剂的高背景噪声而经常遭受不良信号-噪声比。Alexandrov等[5]已经描述了用于测量膜蛋白的热稳定而无需使用配体的另一种方法。这依赖于天然半胱氨酸残基对共价修饰的可实现性作为展开方法的示值读数。蛋白质展开导致包埋的半胱氨酸的暴露，这使得其易于被反应性荧光探针修饰。在已知的分析中，作者使用巯基特异的荧光染料N-[4-(7-二乙氨-4-甲基-3-香豆素基)苯基]马来酰亚胺(CPM)，因为其在未结合的形式中几乎不显示荧光。然而，这种分析的主要缺点是其不适合于高通量应用。它需要相当大量的高纯度的膜蛋白制剂，因为所述检测系统对于膜蛋白不是特异的。Knepp等(Biochemistry50(4):502-11,2011)描述了使用荧光共振能量转移(FRET)[6]来评估膜蛋白稳定性。FRET依赖于从供体荧光团到接受体荧光团的能量的距离依赖性转移。重要的是，供体和接受体荧光团必须具有良好分离的发射光谱，但供体的发射光谱必须与接受体荧光团的激发光谱相重叠。在Knepp等的方法中，标记有FRET接受体的单克隆抗体的结合被用作GPCR变性的标记物。当FRET接受体是在连接至GPCR的C-末端的FRET供体邻近时产生FRET信号。然而，这种方法的显著限制是其需要可用的对讨论的膜蛋白特异的合适抗体。另外，Knepp等的方法不可能鉴定发生在抗体结合位点的稳定化突变，因为这些突变会降低或消除抗体结合。此外，在抗体结合位点的突变可能增加抗体对受体的亲和性而不必增加构象稳定性，从而导致假阳性。Knepp等的方法的另一个缺点是，所述抗体可对GPCR的药理学具有特定影响。例如，所述抗体可以是不希望的GPCR的特定构象。因此，对于可用于测量膜蛋白稳定性的简单有效的分析仍然存在很大需求。展开时的蛋白聚集是所有蛋白的一般特征，其在不同蛋白以不同程度发生。认为蛋白质的整体结构稳定性与聚集水平成反比。已知膜蛋白溶解后显示出高水平的聚集，在变性后更加如此。有各种方法适用于测量聚集，但不适用于测量变性后的膜蛋白聚集。例如，Pollitt等(Neuron40:685-694,2003)和US7,803,559描述了基于细胞的分析，其利用FRET来测量细胞内多聚谷氨酰胺蛋白聚集，并讨论了将其用在筛选在神经退行性疾病中可具有治疗应用的聚集调节剂。此外，Roberti等(NatureMethods4(4):345,2007)和Rajan等(PNAS98(23):13060-13065)描述了基于FRET的方法，其用于评估已知形成作为疾病病理部分的聚集物的蛋白聚集。还可以通过上述的分析技术测量蛋白聚集。然而，所有这些方法都需要高度纯化的蛋白。尽管有上述进展，用于测量膜蛋白聚集的方法不是广泛可用的。这主要是因为这些方法需要大量的高度纯化的蛋白质，而产生高度纯化的膜蛋白是具有挑战性的。
技术实现思路
本专利技术人现在已经鉴定了用于直接评估膜蛋白聚集的方法。这样的方法允许人们鉴定使蛋白质的整体聚集最小化的条件和突变。与间接测量聚集的方法，诸如Knepp等的那些相比，认为本专利技术的方法鉴定更多的可以最小化蛋白聚集的突变和条件。这是因为某些突变和条件可以减少蛋白聚集，且不以导致配体结合或抗体结合改变的方式改变蛋白质的结构，而在间接方法中，依赖所述配体结合或抗体结合作为聚集的示值读数。根据本专利技术的第一方面，提供用于评估膜蛋白构象稳定性的分析，包括：(a)提供包含膜蛋白的第一群体和第二群体的样本；其中在所述第一群体中的膜蛋白标记有供体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有接受体标记，或者在所述第一群体中的膜蛋白标记有接受体标记以及在所述第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于评估膜蛋白构象稳定性的分析，包括：(a)提供包含膜蛋白的第一群体和第二群体的样本；其中在所述第一群体中的膜蛋白标记有供体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有接受体标记，或者在所述第一群体中的膜蛋白标记有接受体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有供体标记；(b)将所述膜蛋白的第一和第二群体暴露至稳定性调节剂和/或条件；(c)以及，通过激活所述供体标记以允许与所述接受体标记进行产生可检测信号的距离依赖性相互作用，来评估在所述第一和第二群体的膜蛋白之间的聚集。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.01 US 61/654,2651.一种用于评估膜蛋白构象稳定性的方法，包括：a.提供包含膜蛋白的第一群体和第二群体的样本；其中在所述第一群体中的膜蛋白标记有供体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有接受体标记，或者在所述第一群体中的膜蛋白标记有接受体标记以及在所述第二群体中的膜蛋白标记有供体标记，其中以溶解的形式提供所述膜蛋白的群体；b.将所述膜蛋白的第一和第二群体暴露至变性条件；c.以及，通过激活所述供体标记以允许与所述接受体标记进行产生可检测信号的距离依赖性相互作用，来评估在所述第一和第二群体的膜蛋白之间的聚集。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜蛋白的第一群体和第二群体以1：1的比存在于样本中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述供体标记共价连接到膜蛋白以及接受体标记共价连接到膜蛋白。4.一种用于评估膜蛋白构象稳定性的方法，包括：a.提供包含膜蛋白群体的样本，其中以溶解的形式提供所述膜蛋白群体；b.将所述膜蛋白群体暴露至变性条件；c.使用供体标记来标记所述膜蛋白的N-末端或C-末端中的一个，以及使用接受体标记来标记所述膜蛋白的N-末端或C-末端中的另一个；d.以及，通过激活所述供体标记以允许与所述接受体标记进行产生可检测信号的距离依赖性相互作用，来评估在群体中所述膜蛋白的聚集。5.根据权利要求1或4所述的方法，其中在所述供体标记和所述接受体标记之间的相互作用涉及从供体荧光团向接受体荧光团的能量转移。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述供体荧光团是镧系元素。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述镧系元素是铽。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述接受体荧光团是EGFP或d2。9.根据权利要求1或4所述的方法，其中在所述供体标记和所述接受体标记之间的相互作用是化学发光反应。10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述供体标记和所述接受体标记之间的相互作用涉及启动化学发光反应的单线态氧分子的生成。11.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述供体标记和/或接受体标记直接连接至膜蛋白。12.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述供体标记和/或接受体标记间接连接至膜蛋白。13.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述样本包含选自十二烷基麦芽糖苷；C11-、C10-、C9-或C8-麦芽糖苷或葡萄糖苷；月桂基二氧化物；和十...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·H·马歇尔，S·A·亚扎那力戴瓷弗，J·C·帕特勒，
申请(专利权)人：赫普泰雅治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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