miRNA检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种miRNA检测方法及应用。具体地，本发明专利技术提供了一种检测miRNA的新方法(称为aLHCD)，该方法包括：(a)将含miRNA的样品与双发夹核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含“miRNA-杂交探针”的第一复合物的液相混合物；(b)对第一复合物，用限制性内切酶进行消化，形成一端保留发夹结构区的第二复合物；(c)用单链外切酶对第二复合物进行消化，形成第三复合物；(d)以经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增；(e)检测PCR扩增产物的存在与否和/或数量，得出待测miRNA的检测结果。本发明专利技术方法具有高特异、高灵敏和便利性等特点，不仅可同时检测多种miRNA，还可区分miRNA及其前体。本发明专利技术方法可应用于生物学检测和临床医学。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种miRNA检测方法及应用。具体地，本专利技术提供了一种检测miRNA的新方法(称为aLHCD)，该方法包括：(a)将含miRNA的样品与双发夹核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含“miRNA-杂交探针”的第一复合物的液相混合物；(b)对第一复合物，用限制性内切酶进行消化，形成一端保留发夹结构区的第二复合物；(c)用单链外切酶对第二复合物进行消化，形成第三复合物；(d)以经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增；(e)检测PCR扩增产物的存在与否和/或数量，得出待测miRNA的检测结果。本专利技术方法具有高特异、高灵敏和便利性等特点，不仅可同时检测多种miRNA，还可区分miRNA及其前体。本专利技术方法可应用于生物学检测和临床医学。【专利说明】miRNA检测方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种检测miRNA的新方法（称为aLHCD)、及 其在生物学检测和临床医学中的应用。
技术介绍
miRNA是约22个碱基长的微型非编码RNA，它的产生是一个梯级的过程。RNA 聚合酶II或III转录产生的长非编码RNA(称为pri-miRNAs)，首先由RNA酶DR0SHA剪 切，产生约60-70bp长的前体分子（称为pre-miRNAs)，再经由DICER剪切，产生成熟的 miRNA[D.P.Bartel,Cell,116 (2), 281(2004),K.Okamura,WileyInterdiscipRevRNA, 3(3)，351 (2011)】。 现今，业已证明miRNA是基因表达调控的一个关键子，它可影响几乎每个细胞 生物学事件，并能参与大部分的人类疾病【Y.Huang,X.J.Shen，Q.Zouetal.，JPhysiol Biochem，67(1)，129(2010)】。 由于miRNA如此重要，对其研究呈爆炸性的增长，但miRNA检测方法的研究明显滞 后于miRNA自身的研究。 MiRNA检测方法明显滞后的原因，主要是由miRNA自身独特的特点所决定的 【K.A.Cissell，S.Shrestha，andS.K.Deo,AnalyticalChemistry79 (13)，4754 (2007) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011)]：一是miRNA分子喊 基序列特别短，杂交时的退火温度低，从而影响杂交的严紧性；二是miRNA与其家族成员仅 有几个碱基乃至单个碱基的区别，与其多个靶基因也有相似的序列，与其前体更是有完全 相同的序列【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;H. Zhou,M.L.Arcila,Z.Lietal.,NucleicAcidsRes40 (13), 5864 (2012) ;M.Thomas,J. Lieberman,andA.Lai,NatStructMolBioll7(10), 1169(2010)】，这对miRNA的检测特异 性提出了极大的挑战；三是miRNA没有poly-A尾巴和5'帽子，这阻止了常规方法对其特异 性的纯化，从而影响检测的灵敏度和特异性；四是miRNA极短的碱基序列也使引物的设计 十分困难，从而影响PCR方法的运用；五是不同的GC含量需要不同的退火温度，特别是对 miRNA这样很小的分子而言更为明显，这就严重影响了多个miRNA的同时检测。 尽管困难重重，各种各样的miRNA检测方法也涌现出来【K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394 (4), 1109 (2009) ;S.TakadaandH.Asahara,Mod Rheumatol(2012)】。目前为止，常用的miRNA检测方法主要有三大类，其中Northern blotting被看成是检测单个miRNA的金标准，PCR适合高灵敏的检测，芯片适合高通量 的分析【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011);E.vanRooij,Circ Resl08 (2), 219 (2011)】。但是Northernblotting方法操作复杂，费时费力，灵敏度低，不 适合高通量分析。stemloop-PCR因为引物的设计有很大的困难限制了它的应用。芯片虽 然可用于多通量的分析，但特异性和可重复性低。 总之，目前的方法很难做到对miRNA高特异、高灵敏和便利性的检测【P.Chugh andD.P.Dittmer,ffileyInterdiscipRevRNA3 (5), 601 (2012);K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394(4), 1109(2009)】。因此，本领域迫切需要开发高特异、高 灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高特异、高灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA 的方法。 在本专利技术的第一方面，提供了一种miRNA检测方法，包括步骤： (a)将含miRNA的样品与核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含"miRNA-杂交探 针"的第一复合物的液相混合物，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的 双发夹核酸探针具有： (i)位于5'端的第一发夹结构区； (ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及 (iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互 补的互补结合区； (b)对所述的"miRNA-杂交探针"第一复合物，用限制性内切酶进行消化，从而从 所述第一复合物中切除第一发夹结构区或第二发夹结构区，形成一端保留发夹结构区的、 经酶切的第二复合物，其中所述的限制性内切酶仅切除第一发夹结构区或第二发夹结构区 而不切割第一复合物的其他区域； (c)用单链外切酶对所述第二复合物进行消化，从而切除所述第二复合物中在步 骤（b)中切除发夹结构区所暴露出的核酸单链，形成第三复合物，并同时切除多余的未杂 交探针，其中所述第三复合物由经双重消化后的核酸探针和miRNA构成； ⑷以所述的经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增，从而获得PCR 扩增产物，其中所述扩增产物含有对应于所述待测miRNA序列的核酸序列区； (e)检测所述PCR扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测miRNA的检测结 果。 在另一优选例中，所述的检测结果为定性或定量结果。 在另一优选例中，所述的互补是完全互补。 在另一优选例中，在步骤（d)中，所述的PCR扩增为桥接PCR扩增。 在另一优选例中，在步骤（d)中，在所述的桥接PCR扩增中同时使用桥接引物对和 通用引物对，其中，桥接引物对特异性结合于所述的经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA检测方法，其特征在于，包括步骤：(a)将含miRNA的样品与核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含“miRNA‑杂交探针”的第一复合物的液相混合物，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的双发夹核酸探针具有：(i)位于5'端的第一发夹结构区；(ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及(iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互补的互补结合区；(b)对所述的“miRNA‑杂交探针”第一复合物，用限制性内切酶进行消化，从而从所述第一复合物中切除第一发夹结构区或第二发夹结构区，形成一端保留发夹结构区的、经酶切的第二复合物，其中所述的限制性内切酶仅切除第一发夹结构区或第二发夹结构区而不切割第一复合物的其他区域；(c)用单链外切酶对所述第二复合物进行消化，从而切除所述第二复合物中在步骤(b)中切除发夹结构区所暴露出的核酸单链，形成第三复合物，并同时切除多余的未杂交探针，其中所述第三复合物由经双重消化后的核酸探针和miRNA构成；(d)以所述的经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物，其中所述扩增产物含有对应于所述待测miRNA序列的核酸序列区；(e)检测所述PCR扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测miRNA的检测结果。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张永莲，李湘麒，倪敏捷，张朝宝，马武斌，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31