水稻转录因子Os03g12350基因CDS序列的应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻转录因子Os03g12350基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os03g12350融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如增加水稻籽粒宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
水稻转录因子Os03g12350基因CDS序列的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os03g12350基因CDS序列的应用。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是我国和全世界重要的粮食作物，世界1/2以上人口以水稻为主食，因此水稻产量性状一直以来倍受科学家们的关注，而水稻籽粒大小则是影响产量的主要因素之一。另外，水稻作为农作物基因功能研究的模式植物，与其相关的遗传学和分子生物学研究一直受到研究者们的重视。水稻籽粒的生长发育是一个有次序的、选择性的基因表达过程，转录因子在其基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。禾谷类作物的产量很大程度上取决于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性状的基因调控是重要的研究领域。近年来，已经通过基因克隆、QTL等技术手段揭示了至少8个基因在控制粒型方面具有重要作用。SG1基因编码一个功能未知的蛋白，主要在水稻根和发育的穗中表达，该蛋白的过量表达出现短粒和矮化表型。SG1降低了对油菜素内酯BR的应答，通过减少细胞增殖从而降低诸如种子、穗轴节间等器官的伸长。SGL1是一个类SG1蛋白，具有与SG1类似的功能，通过RNAi下调SG1及其同源基因SGL1的表达，水稻粒长和穗轴的节间较野生型变长(HitoshiNakagawa；AtsunoriTanaka；.etal.SHORTGRAIN1DecreasesOrganElongationandBrassinosteroidResponseinRice.PlantPhysiology,2012,158(3):1208-1219)。GS3位点是控制水稻粒重和粒长的主效QTL，同时也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效QTL(Fan,C；.Xing,Y；.etal.(2006)GS3,amajorQTLforgrainlengthandweightandminorQTLforgrainwidthandthicknessinrice,encodesaputativetransmembraneprotein.TheorApplGenet.112(6):1164-1171)；(HailiangMao,ShengyuanSun.etal.(2010)LinkingdifferentialdomainfunctionsoftheGS3proteintonaturalvariationofgrainsizeinrice.PNAS.11(9):19579-19584)。PGL1是一个非典型的不结合DNA的碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)，过量表达PGL1增加了籽粒长度和重量。APG是PGL1的拮抗性互作因子，两者都定位在核内。PGL1/APG介导的籽粒长度增加是由于内颖细胞长度增加引起的。APG和PGL1不影响已知籽粒长度调控基因GS3和SRS3的表达。PGL1-APG代表了一个新的籽粒长度和重量调控途径，APG是一个负向调节子，其功能受到PGL1的抑制(Heang,D.Sassa,H.etal.(2012)AnatypicalbHLHproteinencodedbyPOSITIVEREGULATOROFGRAINLENGTH2isinvolvedincontrollinggrainlengthandweightofricethroughinteractionwithatypicalbHLHproteinAPG.BreedSci.62(2):133-141)。Mi3(t)基因，来源于籼型水稻Y34，该基因能使粒长缩短35.7％～47.4％，千粒重降低45.9％～62.4％，它主要控制籽粒长度，产生小粒(刘明伟.(2005)水稻显性小粒基因Mi3(t)的精细定位与侯选基因克隆分析.四川农业大学.博士论文)。此外，控制水稻籽粒性状的基因还有gGL7和gGL7-2。转录因子Os03g12350，是ARR-B家族成员，ARR-B家族基因在子粒大小方面尚未见报道。总之，控制水稻籽粒发育是一个复杂过程，涉及到多基因多条途径的协调控制，目前发现调控该性状的基因不多，调控籽粒发育的分子机理尚未阐明，因此，寻找控制籽粒性状发育的基因和新的发掘手段对作物改良并提高作物产量具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻转录因子Os03g12350基因CDS序列的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白(VP16)4-Linker-Os03g12350。其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一起可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。上述融合蛋白中涉及的(VP16)4，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQIDNo.10和SEQIDNo.4所示。上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，编码该Linker的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。上述融合蛋白中涉及的Os03g12350为水稻转录因子Os03g12350，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；水稻转录因子Os03g12350基因的CDS序列为：SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。本专利技术还提供含有编码所述组成型水稻转录因子的基因的载体、工程菌及细胞系。所述载体的构建方法如下：(1)在植物转录因子数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml)中找到Os03g12350基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGCCGGTGGA-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCTCACATCTGTCCACTAAATC-3'。(2)以野生日本晴‘kitaake’水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR，获得Os03g12350基因完整的CDS序列。(3)将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。(4)以植物双元表达载体pCambia1301-UbiN(图6)左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单元、35Spromoter-asRED表达单元和35Spromoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQIDNo.5所示。(5)通过LR反应将Os03g12350基因的CDS序列构建到其目的基因的5’端连有VP64编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因子VP64-Linker-Os03g12350基因的表达载体ubi：VP64-Os03g12350，其全序列如SEQIDNo.6所示。上述表达载体可通过使用Ti质粒、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组成型水稻转录因子，其特征在于，其为融合蛋白（VP16）4‑Linker‑Os03g12350；其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，（VP16）4是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly‑Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；Os03g12350为水稻转录因子Os03g12350，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.融合蛋白(VP16)4-Linker-Os03g12350的编码基因在改良水稻籽粒粒宽中的应用，其特征在于，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，(VP16)4是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间隔形...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏宇，张传玉，刘斌，赵涛，刘军，林辰涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11