【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸检测的PCR和环介导的等温扩增的组合技术
本专利技术涉及用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的方法。另外，本专利技术涉及适合于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的套件试剂盒。
技术介绍
已经证明利用核酸扩增技术检测样品中是否存在特定核酸序列是有力的诊断工具，具有许多应用。聚合酶链式反应(PCR)的引入为对样品中存在的特定靶核酸序列进行快速特异性扩增提供了可能。PCR技术由此为样品中核酸序列的检测提供重要的诊断工具，该技术的引入开启了诊断应用的新领域。如今聚合酶链式反应已为本领域技术人员公知。但是，已经证明难以检测样品中是否存在低拷贝数的多重靶核酸序列。通过并行单重PCR检测数种靶序列(每个都利用对病原体具有特异性的一个引物组)，由于起始材料中的靶DNA的量有限，经常是不可行的。作为选择，由于不同引物组的扩增效率的固有差异，在同一反应中利用多重引物组的多重PCR可能在检测灵敏性上受限。此外，经证明PCR技术耗时并且在许多应用的实践中难以处理，这是因为要求热循环的许多次重复循环(当进行PCR过程中的不同步骤时温度循环改变)。热循环的要求还引起制造合适的检测装置方面的问题，所述检测装置中快速冷却和加热的要求给装置制造者带来技术设计问题。为了提供更简单的装置，等温扩增技术会是更合适的。为了规避该困难和其它困难，已经开发出许多用于核酸序列扩增的替代方法，例如等温技术，如转录介导的扩增(TMA)或自持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、RNA的信号介导扩增技术(SMART)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、DNA的环介导等...
【技术保护点】
用于检测样品中是否存在一种或多种靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供样品，b.可选地从所述样品中提取核酸序列，由此提供核酸提取物样品，c.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物(a)和引物(b)，所述引物(a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其(3’)下游序列基本上互补的3’部分；所述引物(b)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其(5’)上游序列基本上同源的3’部分；所述核酸引物对适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应(PCR)介导的扩增，d.为每一种或多种靶核酸序列提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物(c)和引物(d)，所述引物(c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分基本上互补的3’部分(c1)和与所述靶序列的第二部分基本上同源的5’部分(c2)，所述靶核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的(5’)上游；所述引物(d)包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分基本上同源的3’部分(d1)和与所述靶序列的第三部分基本上互补的5’部分(d2)，所述第三部分位于所述第二部分的(5’)上游，并且第四部...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.14 DK PA201200339;2012.10.05 EP 12187507.41.用于检测样品中是否存在两种以上靶核酸序列的非诊断方法，所述方法包括以下步骤：a.提供样品，c.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物a)和引物b)，所述引物a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其3’下游序列互补的3’部分；所述引物b)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其5’上游序列同源的3’部分；所述核酸引物对适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应介导的扩增，d.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物c)和引物d)，所述引物c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分互补的3’部分c1和与所述靶序列的第二部分同源的5’部分c2，所述靶核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的5’上游；所述引物d)包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分同源的3’部分d1和与所述靶序列的第三部分互补的5’部分d2，所述第三部分位于所述第二部分的5’上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分的5’上游，所述核酸引物组c)和d)适用于扩增所述靶核酸序列的环介导扩增反应，f.使步骤a的样品在步骤c提供的核酸引物对的存在下进行至少一个循环的聚合酶链式反应扩增，由此提供预扩增样品，其中所述样品中的所述两种以上靶核酸序列的量增加，所述预扩增样品分为两个以上子样品，g.使用步骤d中提供的核酸引物对，使步骤f的两个以上预扩增子样品或其子样品进行环介导扩增反应，由此提供样品反应产物，h.使用常规技术在步骤g的样品反应产物中检测是否存在核酸扩增产物。2.用于检测样品中是否存在两种以上靶核酸序列的非诊断方法，所述方法包括以下步骤：a.提供样品，b.从所述样品中提取核酸序列，由此提供核酸提取物样品，c.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物a)和引物b)，所述引物a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其3’下游序列互补的3’部分；所述引物b)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其5’上游序列同源的3’部分；所述核酸引物对适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应介导的扩增，d.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物c)和引物d)，所述引物c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分互补的3’部分c1和与所述靶序列的第二部分同源的5’部分c2，所述靶核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的5’上游；所述引物d)包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分同源的3’部分d1和与所述靶序列的第三部分互补的5’部分d2，所述第三部分位于所述第二部分的5’上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分的5’上游，所述核酸引物组c)和d)适用于扩增所述靶核酸序列的环介导扩增反应，f.使步骤a或b的样品在步骤c提供的核酸引物对的存在下进行至少一个循环的聚合酶链式反应扩增，由此提供预扩增样品，其中所述样品中的所述两种以上靶核酸序列的量增加，所述预扩增样品分为两个以上子样品，g.使用步骤d中提供的核酸引物对，使步骤f的两个以上预扩增子样品或其子样品进行环介导扩增反应，由此提供样品反应产物，h.使用常规技术在步骤g的样品反应产物中检测是否存在核酸扩增产物。3.用于检测样品中是否存在两种以上靶核酸序列的非诊断方法，所述方法包括以下步骤：a.提供样品，c.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物a)和引物b)，所述引物a)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其3’下游序列互补的3’部分；所述引物b)具有与需要检测其存在与否的靶序列的一部分或其5’上游序列同源的3’部分；所述核酸引物对适合用于对包含所述靶核酸序列的核酸序列进行聚合酶链式反应介导的扩增，d.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供核酸引物对，所述核酸引物对包含引物c)和引物d)，所述引物c)具有与需要检测其存在与否的靶序列的第一部分互补的3’部分c1和与所述靶序列的第二部分同源的5’部分c2，所述靶核酸序列的所述第二部分位于所述靶序列的第一部分的5’上游；所述引物d)包含与需要检测其存在与否的靶序列的第四部分同源的3’部分d1和与所述靶序列的第三部分互补的5’部分d2，所述第三部分位于所述第二部分的5’上游，并且第四部分位于所述靶核酸序列的第三部分的5’上游，所述核酸引物组c)和d)适用于扩增所述靶核酸序列的环介导扩增反应，e.为两种以上靶核酸序列中的每一种提供一个或多个核酸引物e)和f)，所述引物e)具有与所述靶序列的第五部分同源的序列，所述第五部分位于所述靶核酸序列的第一部分的5’上游和所述靶核酸序列的第二部分的3’下游，所述引物f)具有与所述靶序列的第六部分互补的序列，所述第六部分位于所述靶核酸序列的第三部分的5’上游和所述靶核酸序列的第四部分的3’下游，f.使步骤a的样品在步骤c提供的核酸引物对的存在下进行至少一个循环的聚合酶...
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