本发明专利技术提供一种重组革兰氏阴性细菌细胞，细胞特征在于：a.包含编码DsbC的重组多核苷酸；以及b.与野生型细胞相比其具有降低的Tsp蛋白质活性。
【技术实现步骤摘要】
表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株 本申请是申请日为2011年1月13日、申请号为201180005978. 1、专利技术名称为表 达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株的专利技术专利申请的分案申请。 本本专利技术涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌（E.Coli)。本专利技术还涉及在此 细胞中产生目的蛋白质的方法。 专利技术背景 通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生 产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞可以使得基因通过质粒 插入而具有多样的属性。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。 尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括 难以生产蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中转换老旧、损坏或 折叠错误的蛋白质上起到重要作用。细菌蛋白酶起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常 显著降低活性蛋白质的产量。 已经鉴定出大量的细菌蛋白酶。大肠杆菌中的蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、 OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP和lon〇Tsp(也称为Prc)为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一个已知的Tsp底物 为青霉素结合蛋白质 _3(PBP3)(Determinationofthecleavagesiteinvolvedin C-terminalprocessingofpenicillin-bindingprotein3ofEscherichiacoli； NagasawaH,SakagamiY,SuzukiA,SuzukiH,HaraH,HirotaY.JBacteriol. 1989Nov； 171 (11):5890-3 和Cloning,mappingandcharacterizationoftheEscherichiacoli TspgenewhichisinvolvedinC-terminalprocessingofpenicillin-binding protein3；HaraH,YamamotoY,HigashitaniA,SuzukiH,NishimuraY.J Bacteriol. 1991Aug;173 (15) :4799-813)，但后来发现Tsp还能够裂解噬菌体尾巴蛋白 质，因此将其改名为尾特异性蛋白酶（TailSpecificProtease,Tsp) (5;[]^61'等人，？1'〇(3. Natl.Acad.Sci.USA, 89:295-299(1992))。Silber等人（Deletionoftheprc(tsp) geneprovidesevidenceforadditionaltail-specificproteolyticactivityin EscherichiacoliK-12;Silber，K.R.，Sauer,R.T.;MolGenGenet1994242:237-240)描 述了一种prc删除菌株（KS1000)，其中的突变是通过将包含Kanr标记物的片段取代prc基 因的片段而形成的。Tsp(prC)活性降低对降低目的蛋白的蛋白水解是可取的。然而，发现 缺少蛋白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。Hara等人分离了 含有基因外抑制子（spr)突变的耐热性回复突变株（Hara等人，MicrobialDrug Resistance, 2:63-72(1996))。spr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp 以及外膜中参与细胞分裂中细胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI) 〇 包含有突变spr基因的蛋白酶缺陷菌株已有描述。Chenetal(ChenC,Snedecor B,NishiharaJC,JolyJC,McFarlandN,AndersenDC,BattersbyJE,Champion KM.BiotechnolBioeng. 2004Mar5 ;85 (5) :463-74)描述了携带prc(Tsp)及另一种蛋白酶DegP的不同突变组合的大肠杆菌菌株的构建，是通过扩增基因上游及下游区域并将其一起 连接于包含选择性标记物及sprW174R突变的载体上而产生的（重组抗体片段在大肠埃希 式杆菌的细胞周质中高水平积累需要三重突变体（ADegPAprcSprW174R)宿主菌株。发现 ADegP、Aprc和sprW174R突变的组合提供最高水平的抗体轻链、抗体重链及F(ab'）2-LZ。 EP1341899公开了在编码蛋白酶DegP和Prc的染色体DegP和prc分别有缺陷的大肠杆菌 菌株，此菌株还具有突变spr基因，其编码的蛋白质抑制了包含prc突变体的菌株表现出的 生长表型。 蛋白质-硫键异构酶为在蛋白质折置时，[隹化其中半胱；氣fe残基见-硫键形成和 断裂的酶。已知其与催化二硫键形成的蛋白质共表达而改善宿主细胞中的蛋白质表达。 W098/56930公开了一种在细菌中产生含二硫键的异源多肽的方法，其中原核二硫键异构酶 如DsbC或DsbG与真核多肽共表达。US6673569公开了包含编码DsbA、DsbB、DsbC和DsbD 中每种的多肽的人工操纵子，用于产生外源蛋白质。EP0786009公开了用于在细菌中生产异 源多肽的过程，其中在诱导编码异源多肽的核酸表达之前诱导编码DsbA或DsbC的核酸表 达。DsbC是一种发现于大肠杆菌细胞周质中的原核蛋白质，其催化大肠杆菌中二硫 键的形成。DsbC的氨基酸序列长度为236(包括信号肽），分子量为25.6KDa(UniProt No.POAEGGhDsbC于 1994年首次发现（Missiakas等人TheEscherichiacolidsbC(xprA) geneencodesaperiplasmicproteininvolvedindisulfidebondformation,TheEMB0 Journalvol13,no8,p2013-2020, 1994 以及Shevchik等人CharacterizationofDsbC,a periplasmicproteinofErwiniachrysanthemiandEscherichiacoliwithdisulfide isomeraseactivity,TheEMB0Jounralvol13,no8,p2007-2012, 1994)〇 出乎意料地发现在革兰氏阴性细菌细胞中由重组DsbC过表达DsbC改善了缺乏蛋 白酶Tsp的细胞的细胞裂解表型。因此，本专利技术提供了新菌株，其具有用于产生目的蛋白质 的优势特性。 专利技术概述 本专利技术提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，细胞的特征在于：a)包含编码DsbC的重组多核苷酸；以及b)与野生型细胞相比，具有降低的Tsp蛋白质活性。 在一个实施方式中，细胞包含野生型spr基因。在此实施方式中，优选地，除了降 低Tsp蛋白质活性所需的修饰之外，细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的。 在一个进一步的实施方式中，根据本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组革兰氏阴性细菌细胞，特征在于所述细胞：a.包含含有编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体；b.具有突变的Tsp基因，其编码与野生型非突变Tsp相比，具有50％或更低蛋白酶活性的Tsp蛋白质；并且c.具有除了突变的Tsp基因外，与野生型大肠杆菌W3110菌株同基因的基因组。
【技术特征摘要】
2010.01.14 GB 1000591.61. 重组革兰氏阴性细菌细胞，特征在于所述细胞： a. 包含含有编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体； b. 具有突变的Tsp基因，其编码与野生型非突变Tsp相比，具有50%或更低蛋白酶活 性的Tsp蛋白质；并且 c. 具有除了突变的Tsp基因外，与野生型大肠杆菌W3110菌株同基因的基因组。2. 根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含编码突变spr蛋白质的突变spr 基因，所述突变 spr 蛋白质具有选自 H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、 R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A 和 G147C 的一个或 多个突变。3. 根据权利要求2的细胞，其中所述spr蛋白质的一个或多个突变选自S95F、V98E、 Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。4. 根据权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有突变S95F和 Y115F。5. 根据权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有选自C94A、 D133A、H145A 和 H157A 的突变。6. 根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含一种或多种以下突变基因： a. 编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变DegP基因； b. 突变ptr基因，其中所述突变ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III或 其为敲除突变ptr基因；以及 c. 突变OmpT基因，其中所述突变OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质 或其为敲除突变OmpT基因。7. 根据权利要求1的细胞，其中所述细胞包含的突变Tsp基因编码与野生型非突变 Ts...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·埃里斯，D·P·哈姆费雷斯，
申请(专利权)人：UCB医药有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE
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