一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，属于荧光生物传感器领域。首先，将TPP-DMAE溶解于DMSO中，加入高糖DMEM培养基，得到混合溶液；将癌细胞传代至培养皿中，培养，洗涤，加入混合溶液和高糖DMEM培养基，培养，洗涤，加入固定剂，静置，洗涤，加入缓冲液，得到待测样品；检测待测样品的荧光强度，通过对比癌细胞自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度-时间变化率与失活细胞通入气体后的荧光强度-气体体积变化率随的数值，相同的荧光强度变化率对应的时间以及通入气体的体积即为癌细胞在不同时间内自身新陈代谢产生的CO2体积。所述方法可定量检测活性细胞新陈代谢所产生二氧化碳含量，并实现对癌细胞的类型进行甄别。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法
本专利技术涉及一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，属于荧光生物传感器领域。
技术介绍
新陈代谢是生物维持生命活动的基本条件，生命过程中所表现出来的生长、发育、遗传和变异等特征都是以新陈代谢为基础的。机体生理功能和生化功能的正常活动完全依赖于细胞的正常生理和新陈代谢，当细胞出现病变时，人体便发生疾病，而新陈代谢一旦停止，生命也将终结。因而，实现细胞新陈代谢的记录和监控具有重大意义。其中，活性癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞自身释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等。若能实现对癌细胞代谢过程的定量及可视化监控，对于人类解决癌症难题具有重大意义。癌细胞在生长繁殖过程中，不断地与外界发生物质和能量交换，如果通过二氧化碳含量变化监测其代谢过程，对于癌细胞的甄别，进而实现早期诊断具有重要意义。因而，科研人员开发了一系列荧光探针(如荧光蛋白、无机量子点等)用于细胞成像。然而，荧光蛋白的摩尔吸光系数有限、光漂白现象严重以及光稳定性差，无机量子点由于重金属离子的存在而具有高细胞毒性。这些大大限制了其实际应用，因而开发具有高生物相容性、光稳定性以及细胞成像有效发射的新型生物探针是至关重要的。目前，大多数文献报道的荧光探针可以实现细胞成像，但由于细胞毒性问题无法实现长时间持续监测，并且这些荧光探针都对二氧化碳没有响应，无法监测细胞的新陈代谢过程。(Warburg,O.；Biochem.Z.,1924,152,319-344.Craig,F.N.；Beecher,H.K.；J.Gen.Physiol.,1943,26,473-478.Goldsmith,A.E.；Narvaez,R.；Oncology,1975,32,247-265.Wang,L.K.；Tian,Y.P.；J.Phys.Chem.C,2014,118,8531-8540.Zhang,X.Y.；Wei,Y.；Appl.Mater.Interfaces,2013,5,1943-1947.Bhunia,S.K.；Jana,N.R.；Appl.Mater.Interfaces,2014,6,7672-7679.Hong,Y.N.；Tang,B.Z.；J.Am.Chem.Soc.,2013,135,62-65.Miyake,T.；McDermott,J.C.；Gramolini,A.O.PloSOne,2011,6,e28628.Neto,B.a.D.；Carvalho,P.H.P.R.；Silva,R.G.；RSCAdv.,2012,2,1524-1532.Ye,J.H.；Chen,H.C.；Bai,Y.；RSCAdv.,2014,4,6691-6695.Collado,D.；Vida,Y.；Najera,F.；RSCAdv.,2014,4,2306-2309.)。
技术实现思路
针对目前对癌细胞代谢过程进行检测采用的荧光探针用于活细胞成像时，不具备定量检测细胞所产生二氧化碳，不能监测癌细胞代谢过程的问题，本专利技术的目的在于提供一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法采用一种含有4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯(TPP-DMAE)荧光探针对活细胞的新陈代谢过程进行检测，所述荧光探针用于癌细胞荧光成像的同时可定量检测癌细胞新陈代谢所产生二氧化碳含量，并实现对癌细胞的类型进行甄别。本专利技术的目的由以下技术方案实现：一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法具体步骤如下：(1)将TPP-DMAE溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10-5mol/L的溶液b；(2)将癌细胞传代至培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于培养箱中培养20～24h，洗涤，向培养皿中依次加入相同体积的溶液b和高糖DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5～10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入固定剂，静置5～10min，洗涤，加入缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；(3)首先观察待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞和的成像情况；再测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；其中，测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6～10次；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：首先，测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后向待测样品2中通入气体，测试通入气体后待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入气体20～40次，每次气体的通入量相等；(4)根据步骤(3)待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试结果计算癌细胞产生的CO2含量，具体为：首先，根据测试结果绘制待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；绘制待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；两条曲线中的荧光变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为癌细胞在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；待测样品1中癌细胞荧光强度变化率＝(Ii-I0)/I0，I0表示癌细胞的初始荧光强度，Ii表示第i次检测时癌细胞的荧光强度，i为1～9的正整数；测样品2中失活细胞荧光强度变化率＝(I′k-I′0)/I′0，I′0表示失活细胞的初始荧光强度，I′k表示第k次通入气体后失活细胞的荧光强度，k为1～40的正整数；其中，步骤(1)所述TPP-DMAE为4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯的简写，TPP-DMAE的结构式如下：步骤(2)所述癌细胞优选子宫颈癌细胞(Helacell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)；所述培养皿为激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿；培养参数优选温度为37℃，CO2体积含量为5％；洗涤优选采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，洗涤次数优选三次；溶液b的体积优选0.1-1.0mL；固定剂添加量优选1mL；缓冲液优选pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；步骤(3)所述成像情况和荧光强度均优选采用激光共聚焦显微镜；气体优选CO2和CO2与空气体积比为1:1的混合气体中的一种；待测样品2与每次通入的气体的体积比为1000:1；有益效果：(1)本专利技术所述方法采用荧光探针对Helacell、MCF-7cell代谢产生的二氧化碳具有特异性荧光响应；可定量检测癌细胞新陈代谢产生的二氧化碳的含量；(2)本专利技术所述方法采用荧光探针对于二氧化碳有特异性的荧光响应，可对癌细胞(人子宫颈癌细胞(Helacell)和人乳腺癌细胞(MCF-7cell))进行细胞成像，荧光探针进入细胞迅速，能立刻在细胞内观察到荧光探针，而在细胞外无明显现象，有立竿见影的细胞成像效果；(3)本专利技术所述方法采用荧光探针Helacell、MCF-7cell代谢产生的二氧化碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：(1)将TPP‑DMAE溶解于二甲基亚砜中，得到浓度为1×10‑2mol/L的溶液a；向溶液a中加入DMEM培养基，得到TPP‑DMAE的浓度为1×10‑5mol/L的溶液b；其中，TPP‑DMAE为4,4',4″‑(1H‑吡咯‑1,2,5‑三基)三苯甲酸(2‑二甲氨基)乙酯的简写，TPP‑DMAE的结构式如下：(2)将癌细胞传代至培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于培养箱中培养20～24h，洗涤，向培养皿中依次加入相同体积的溶液b和DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5～10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入固定剂，静置5～10min，洗涤，加入缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；(3)测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；其中，测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6～10次，其中，第一次的测试结果记为癌细胞的初始荧光强度；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：首先，测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后向待测样品2中通入CO2气体，或CO2与空气体积比为1:1的混合气体，测试通入气体后待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入气体20～40次，每次气体的通入量相等；(4)根据步骤(3)待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试结果计算癌细胞产生的CO2含量，具体为：首先，根据测试结果绘制待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；绘制待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；两条曲线中的荧光变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为癌细胞在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：(1)将TPP-DMAE溶解于二甲基亚砜中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入DMEM培养基，得到TPP-DMAE的浓度为1×10-5mol/L的溶液b；其中，TPP-DMAE为4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯的简写，TPP-DMAE的结构式如下：(2)将癌细胞传代至培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于培养箱中培养20～24h，洗涤，向培养皿中依次加入相同体积的溶液b和DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5～10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入固定剂，静置5～10min，洗涤，加入缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；(3)测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；其中，测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6～10次，其中，第一次的测试结果记为癌细胞的初始荧光强度；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：首先，测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后向待测样品2中通入CO2气体，或CO2与空气体积比为1:1的混合气体，测试通入气体后待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入气体20～40次，每次气体的通入量相等；(4)根据步骤(3)待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试结果计算癌细胞产生的CO2含量，具体为：首先，根据测试结果绘制待测样品1中癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：董宇平，王焕，陈笛笛，张亚会，石建兵，佟斌，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11