一种基于SCAR标记鉴定坛紫菜品系的方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种基于SCAR标记鉴定坛紫菜品系的方法，即用SCAR标记鉴定坛紫菜“浙东1号”品系，其中SCAR标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；从SCAR标记上设计的引物的序列为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，PCR扩增片段大小为220bp。本发明专利技术采用分子标记技术鉴定坛紫菜“浙东1号”，结果不受环境因素影响，准确可靠；本发明专利技术提供的SCAR标记具有操作快速简单、检测结果稳定及成本低廉等优点；本发明专利技术提供的SCAR标记法也可应用于坛紫菜其它品系的特异性标记筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种基于SCAR标记鉴定坛紫菜品系的方法
本专利技术属于分子生物学DNA标记检测
，涉及一种基于SCAR标记鉴定坛紫菜品系的方法，即用SCAR标记鉴定坛紫菜“浙东1号”品系的方法。
技术介绍
坛紫菜是我国特有的具有重要经济价值的暖温带大型海洋藻类，主要栽培于浙江、福建、广东三省，产量约占全国紫菜产量的80％。早些年因使用未进行人工选育的野生种质而发生紫菜烂苗、抗逆性低、产量下降等现象，造成巨大的经济损失，因此，坛紫菜良种选育的工作迫在眉睫。特别是浙江海域和福建北部海域，海水浑浊，含有大量的砂质颗粒，在潮流、风浪作用下，对海区栽培的紫菜造成机械损伤，藻体较薄的紫菜损伤的程度更大。而藻体厚的紫菜具有一定是抵御泥沙的冲击能力，能够减轻藻体的损伤程度。坛紫菜多是潮间带插杆的方式栽培，栽培的位置往往在沿海的内湾，海水的透明度差，一般仅仅在15～50cm。如果藻体过于细长，不易及时漂浮，光合效率下降，造成减产。而经过长期选育出的“浙东1号”坛紫菜品系的藻体长/宽比值小、叶片厚、皱褶多、基部发达、色素含量高，生长快，可以适应浙闽海域混水区大规模栽培生产，而且能够提高产量，满足加工要求，提高经济效益。但不同的坛紫菜品系，尽管在藻体的色泽、形态等方面存有差异，但这些差异易受海区栽培环境的影响，以往依靠形态学特征的分类法很难准确区分不同品系。导致养殖过程中品系之间发生混淆。因此，应积极开展种质鉴定来保证坛紫菜栽培的良种化，从而提高紫菜采收的经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于SCAR标记鉴定坛紫菜品系的方法，即用SCAR标记鉴定坛紫菜“浙东1号”品系，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种SCAR标记，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；上述的SCAR标记用于制备检测坛紫菜品系的分子标记；所述的分子标记为探针或引物；作为实施例的一种优选，所述的引物的信息如下：正向引物：5'-CTGGATGGAATTTAGACGGT-3'；(SEQIDNO:2)反向引物：5'-CGTGTTCCAGATTTAAGTTGC-3'(SEQIDNO:3)，PCR扩增片段大小为220bp。上述SCAR引物可应用于鉴定坛紫菜“浙东1号”。方法步骤如下：1)总DNA的提取：收集待鉴定坛紫菜叶状体，液氮研磨，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；2)使用SCAR引物，对上述获得的总DNA进行PCR扩增。3)步骤2)的PCR反应体系为：25μl反应体系中，Mix12.5μl，ddH2O8.5μl，正反向引物(10μmol/L)各1μl，模板DNA(DNA浓度5～10ng)2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，接着设置40个循环：94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后72℃延伸7min；4)将3)所得PCR产物进行电泳检测，若PCR扩增产物中出现长度220bp的特异性片段，则所鉴定的坛紫菜为“浙东1号”；若未出现220bp的特异性片段，则所鉴定的坛紫菜不是“浙东1号”。本专利技术采用分子标记技术鉴定坛紫菜“浙东1号”，结果不受环境因素影响，准确可靠；本专利技术提供的SCAR标记具有操作快速简单、检测结果稳定及成本低廉等优点；本专利技术提供的SCAR标记法也可应用于坛紫菜其它品系的特异性标记筛查。附图说明图1：本专利技术的SCAR标记的PCR扩增产物电泳结果，其中：M：100bpDNAladder；1-7泳道：“浙东1号”(ZD-1)，当地传统栽培种(CT)，申福2号(SF-2)，慈溪(CX)，渔山(YS)，南麂(NJ)，平潭(PT)。图2：本专利技术的SCAR标记在“浙东1号”丝状体和叶状体中的扩增结果；其中M：100bpDNAladder；1：“浙东1号”丝状体；2～14：“浙东1号”叶状体；图3：SCAR标记在“浙东1号”F2、F3叶状体中的扩增结果，其中M：100bpDNAladder；1～7：“浙东1号”F2叶状体；8～14：“浙东1号”F3叶状体。具体实施方式本专利技术首先用ISSR-PCR分子标记技术对7个不同品系坛紫菜叶状体DNA进行PCR扩增，筛选获得“浙东1号”的特异性片段，此特异性片段经回收、克隆测序引物设计，最终转化为SCAR标记。本专利技术的SCAR标记可准确快速地鉴定“浙东1号”，可作为良种认证和知识产权保护的分子标记。SCAR(序列特异扩增区，Sequencecharacterizedamplifiedregion)标记是由Paran和Michelmore提出的一种基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，可直接通过扩增片段的有无来鉴别样品间的差异。采用SCAR标记对不同品系坛紫菜DNA进行分析，筛选出特异性片段，可方便快速应用于坛紫菜品系鉴定中。用于鉴定坛紫菜“浙东1号”的分子标记方法步骤如下：(1)总DNA的提取：收集不同品系坛紫菜叶状体，经液氮研磨，使用植物基因组DNA提取试剂盒，分别提取个品系的总DNA。(2)ISSR标记分析：使用ISSR成套引物对步骤(1)所得总DNA进行ISSR-PCR扩增；引物P-899的扩增产物即为鉴定坛紫菜“浙东1号”的分子标记，命名为“ZD-420”。所述引物P-899的序列为：5'-CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA-3'。(3)所述ISSR-PCR反应程序为：94℃预变性5min，接着设置35个循环：94℃变性45s，48℃退火1min，72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min。(4)将(3)取得的扩增产物进行电泳检测：取6μl扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。电泳缓冲液为50×TAE，电压为100V，1h后停止电泳，经凝胶成像系统拍照，结果在引物P-899的扩增结果中找到坛紫菜“浙东1号”一条420bp左右的特异性条带，命名为“ZD-420”。(5)将(4)获得的特异性片段回收、转化、克隆测序，其所得DNA序列为412bp的核苷酸，序列为SEQIDNO:1。(6)SCAR标记引物序列设计：根据步骤(5)中获得的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0设计引物，序列为：正向引物：5'-CTGGATGGAATTTAGACGGT-3'；反向引物：5'-CGTGTTCCAGATTTAAGTTGC-3'，PCR扩增片段大小为220bp。下面结合实施例对本专利技术做更进一步的详细描述。实施例1用于鉴定坛紫菜“浙东1号”的分子标记方法步骤如下：(1)总DNA的提取：收集不同品系坛紫菜叶状体，液氮研磨，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。(2)ISSR标记分析：使用ISSR成套引物对步骤(1)所得总DNA进行ISSR-PCR扩增。(3)ISSR-PCR反应体系：25μl反应体系中，Mix12.5μl，ddH2O8.5μl，引物(10μmol/L)2μl，模板DNA(DNA浓度0.5～1.5ng)2μl。(4)PCR反应程序：94℃预变性5min，接着设置35个循环：94℃变性45s，48℃退火1min，72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min。(5)将(4)取得的扩增产物进行电泳检测：取6μl扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。电泳缓冲液为50×TAE，电压为100V，1h后停止电泳，经凝胶成像系统拍本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SCAR标记，其特征在于，所述的标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列为SEQIDNO:1的SCAR标记在检测坛紫菜“浙东1号”品系中的应用。2.一种引物对，其特征在于，所述的引物对是从核苷酸序列为SEQIDNO:1的SCAR标记上设计的，用于检测坛紫菜“浙东1号”品系；所述的引物对的正向引物和反向引物的序列分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。3.一种鉴定坛紫菜“浙东1号”品系的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：1)总DNA的提取：收集待鉴定坛紫菜叶状体，液氮研磨，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；2)使用权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆其君，徐佳丽，杨锐，陈海敏，王亚军，严小军，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33