一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株VLKDN-1，其保藏号为CCTCC NO：M 2014506。本发明专利技术利用紫外诱变技术，并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株。与出发菌相比，突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活提高了235％，蛋白含量提高了157％；该突变菌的菌落形态明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝短、分枝多。在生产过程中，该突变菌株“小型化”的菌落形态以及菌丝短、分枝多的特点能使发酵菌液的粘度显著降低，达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的，从而有利于降低生产成本，应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】
一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用
本专利技术属于微生物筛选
，具体涉及一种高产纤维素酶的里氏木霉及其在纤维素酶生产中的应用。
技术介绍
里氏木霉(Trichodermareesei)是一种丝状真菌，属于多细胞的真核微生物，是红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性型，分类上隶属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、木霉属。里氏木霉广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、有机肥、土壤和甚至是空气中(Montenecourt&Eveleigh,1979,AdvChemSer.)。里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶，包括外切纤维素酶(CBH1和CBH2)、内切纤维素酶(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等)、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用，将纤维素彻底分解为单糖(Biely&Tenkanen.1998,InTrichodermaandGliocladium)，因此，木霉产纤维素酶已经是二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。但是，木霉纤维素酶和半纤维素酶往往是协同表达的，而影响木霉纤维素酶表达的因素很多。首先，培养碳源的影响：纤维素，乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的，如与诱导表达相关的正调控因子是ACEII和XYR1，而负调控因子是CRE1和ACEI(Ilme′netal.,1997,Mol.Gen.Genet.；Foremanetal.,2003,J.Biol.Chem.)。其次，菌体(菌丝)形态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为，丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低，不适合商业生产。因此，如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生产成本就成为本领域的研究热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株高产纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用，通过紫外诱变的方法获得了一株菌落形态小且高产纤维素酶的里氏木霉突变株，可广泛应用于纤维素酶的生产，降低生产成本。本专利技术一方面提供了一株里氏木霉(Trichodermareesei)突变菌株VLKDN-1，已于2014年10月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2014506。本专利技术还提供了上述里氏木霉突变菌株VLKDN-1在纤维素酶生产中的应用。本专利技术利用紫外诱变技术，并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株。与出发菌相比，突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活提高了235％，蛋白含量提高了157％；该突变菌的菌落形态明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝短、分枝多。在生产过程中，该突变菌株“小型化”的菌落形态以及菌丝短、分枝多的特点能使发酵菌液的粘度显著降低，达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的，从而有利于降低生产成本，应用前景广泛。附图说明图1：出发菌和突变菌的菌落形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉VLKDN-1；图2：出发菌和突变菌的菌丝形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉VLKDN-1。具体实施方式下面结合具体的实施方案对本专利技术进行更详细的描述。但本专利技术并不受所述实施例的限制。提供实施方案的目的是为了使说明书全面而透彻，并向本领域的技术人员全面传达专利技术的范围。除另定义外，本专利技术所使用的所有技术和科学术语均具有作为本专利技术所属
中普通技术人员通常理解的同样的含义。实施例1菌落“小型化”突变菌株的筛选1、菌种处理：将出发菌种里氏木霉(该菌株是本专利专利技术人黄亦钧于2013年6月从青岛市崂山区林场的枯树皮中筛选到的)接种于PDA琼脂平板(马铃薯200-300克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，自来水1000毫升，自然pH)上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子，吸取孢子悬液并计数，依据孢子含量用调整其浓度至105-6个/ml，然后进行后续诱变处理。2、诱变筛选：将上述孢子悬液，加入到空平板中，并进行磁力搅拌(20-550rpm)，然后利用紫外对准平板进行诱变处理，诱变条件为：10-20W紫外灯，照射距离为10-20cm，照射时间为3-5min；然后将诱变后的孢子悬液在暗光或红光条件下涂布于PDA琼脂平板；最后将平板至于30℃恒温培养，直至长出菌落，时间约为7-10天。挑取菌落形态明显小于出发菌的突变体菌分别接种到PDA琼脂平板。实施例2高产纤维素酶突变菌株的筛选1、利用96深孔板筛选：在96深孔板的孔中加入2-3ml诱导培养基，诱导培养基(GLC培养基)的组成为CaCl21.125g/L，葡萄糖10g/L，乳糖20g/L，玉米浆15mlg/L，微量元素10ml/L，KH2PO420g/L，pH5.0；其中微量元素(ME)的组成为FeSO4.7H2O0.75g/L,ZnSO4.7H2O0.06g/L,CuSO4.5H2O0.012g/L,MnSO4.H2O0.053g/L,H3BO30.003g/L。然后将实施例1中筛选到的突变株分别接种于各个孔中，置于摇床上，30℃，200rpm，培养3天。培养结束后，分别离心取上清进行酶活检测和SDS-PAGE电泳检测。根据检测结果，筛选出酶活和胞外蛋白含量显著高于出发菌的突变菌共4株，分别命名为VLKDN-1，VLKDN-2，VLKDN-3，VLKDN-4。(1)酶活测定的方法：CMC法(2)测定的原理：纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。(3)测定过程：取三支试管各加入0.5mlCMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5ml的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml。以第三支试管液为对照在540nm波长条件下测得第一、二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线计算出酶活力值。(4)酶活力计算：酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n式中：180—葡萄糖从微克换算成微摩尔15—待测液与底物的反应时间0.5—加入反应的待测酶液量n—酶样的稀释倍数2、摇瓶筛选：将上述四株突变菌(VLKDN-1，VLKDN-2，VLKDN-3，VLKDN-4)分别接种于500ml三角瓶中(含50mlGLC诱导培养基)，置于摇床上，30℃，200rpm，培养5-7天。培养结束后，分别离心取上清，进行酶活检测(CMC酶活检测法)和蛋白含量测定(考马斯亮蓝检测法)，结果如表1所示。菌株酶活(U/ml)蛋白含量(g/L)出发菌910.41突变菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株里氏木霉菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2014506。

【技术特征摘要】
1.一株里氏木霉（Trichodermareesei）菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CCTCCNO：M2014506。2.权利要求1所述的里氏木霉菌株在纤维素酶生产中的应用。3.一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的里氏木霉菌株接种到...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，吴佳鹏，许丽红，李瑞，王玉明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37